聚丙烯酰凝胶电泳分离血清蛋白质.docVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 Separating Serum Protein by PAGE 一 、目的 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 2.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE）,是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续体系、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成薄的起始区带（厚度1—2mm），然后再进行电泳分离。 聚丙烯酰凝胶电泳的过程中有三种物理效应：（1）样品的浓缩效应，（2）凝胶的分子筛效应，（3）一般电泳的电荷效应。使样品分离效果好，分辨率高。例如人血清用醋酸纤维素薄膜电泳（pH8.6）可以分成5—7个成分，而用聚丙烯酰胺凝胶电泳则可分成20—30条带清晰的成分。 下面就聚丙烯酰胺凝胶电泳说明三种物理效应的原理。 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩 然后再被分离。 （1）凝胶层的不连续性：两层不同的凝胶，其作用如下： 浓缩胶：为大孔胶，样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶 的界面积聚成薄层。 分离胶：为小孔胶，样品在其中进行电泳和分子筛分离。 （2）缓冲液离子成分和电位梯度的不连续性： 在浓缩胶中选择pH6.7，电泳槽缓冲液pH为8.3，HCl几乎全部释放出Cl-,甘氨酸（等 电点在6.0；羧基解离 pKa1 2.34, 氨基—NH3+解离pKa2 9.7）在此条件下有极少部分的分子（1—0.1%）解离成为甘氨酸负离子NH2CH2COO- 在pH6.7下，大部分蛋白质都以负离子形式存在（大多数蛋白质等电点接近于pH5.0）。这三种离子都带有相同电荷，当电泳系统通过一定电流后三种离子同时向正极移动，而且它们的有效泳动率按以下次序排列。 （有效泳动率 泳动率m·解离度d） mCldCl m蛋d蛋 m甘d甘 根据有效率泳动率的大小，最快的称为快离子，最慢的称为慢离子，电泳刚开始时，两种凝胶都含有快离子，只有电泳槽中电泳含慢离子，电泳开始后，由于快离子的泳动率最大，就会很快超过蛋白质，因此，在快离子的后面形成一离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度是成反比的： E（电压梯度） Ι（电流强度）/η（电导率） 所以低电导区就有了较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速运动。当电压梯度和泳动率乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同 ，（即V mE）移动速度 （泳动率 · 电强强度）。在快离子和慢离子移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间，形成一稳定而又不断向阳极移动的界面。由于样品蛋白质的有效泳动率恰好介于快离子之间，因此也就聚集在这个移动界面附近，被浓缩成一个狭小的中间层。 （3）pH的不连续性：在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。要求在浓缩胶中，慢离子较所有分离样品的有效迁移率低，以样品夹在快、、、μl，防止注射器内气泡进入，点样后注射器用蒸馏水充分洗净。 7.电泳 电泳以每厘米2mA开始，待样品进入分离胶时加大电流至3—5mA/cm。当溴酚蓝指示剂到达凝胶板前缘时即停止电泳。 8..染色和脱色 电泳结束后，拿掉胶框并用长针头注射器边注水边轻轻撬开两块玻璃板，将凝胶剥离后，放入染色液中染色20分钟，然后取出放入脱色液中浸泡。注意手不要碰胶片，以防污染胶片。 五、、？