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微生物分离与观察 陈金春,林琳 清华大学微生物学实验室,100084 Chenjc@mail.tsinghua.edu.cn 实验目的和内容 熟悉常用微生物培养基名称; 掌握微生物的分离,接种技术; 用平板划线法和稀释法分离微生物; 认识微生物存在的普遍性; 实验原理 从土壤中分离纯化微生物 土壤中混杂着大量的微生物,从里面分离,得到只含有这一种微生物的纯培养; 根据某微生物对营养,温度,氧气等条件要求不同而供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制剂造成只利于该菌生长,而抑制其他菌生长; 用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离,纯化; 实验仪器,材料和用具 实验材料: 菌源:土样10g; 培养基: 牛肉膏蛋白胨培养基; 实验仪器: 取液器(5000 ul, 1000ul, 200ul 个一支); 培养箱,摇床 实验仪器,材料和用具 实验试剂: 1N NaOH, 1N HCl, 0.9% 无菌生理盐水; 250ml三角瓶中99ml,每瓶加20粒玻璃珠; 250ml三角瓶中50ml,作10倍稀释用; 实验仪器,材料和用具 实验用具: 平皿35个; 无菌有帽试管7只; 无菌涂棒2根; 无菌5000ul, 1000ul, 200ul 吸头各3个; 记号笔,酒精灯; 试管架; 实验步骤——周围环境中微生物的观察 在牛肉蛋白胨平板上作如下实验： 分别用未洗过的手指头,用肥皂洗过的手指头(不用毛巾擦)在平板是涂抹（用力一致）; 用正在使用的毛巾,旧纸币在培养基上拖动; 放置一根头发; 用无菌接种环分别沾一环自来水和河水在平板 上划线； 用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线； 打开培养皿置实验台上（空气中）10min; 按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖1min. 对着培养皿上的培养基咳嗽。 稍稍打开嘴唇压在培养基上; 以上用报纸包好倒置350C培养箱里培养48小时观察结果; 实验步骤——从土壤中分离微生物 采土样: 选择肥沃土壤,去表层土,挖5~20cm深度的土壤数10g,装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口,带回实验室; 倒平板; 实验步骤——从土壤中分离微生物 制备土壤稀释液; 称取土样1.0g， 放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。用1ml的无菌吸头从中吸取0.5ml土壤悬液，注入事先分装有4.5ml无菌水的试管中，吹吸3次，振荡均匀（10-3）。然后同样方法，配置成稀释度为10-4，10-5，10-6的土壤溶液； 实验步骤——从土壤中分离微生物 涂布 用一支新的无菌吸头，分别由各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做2个平板。 实验步骤——从土壤中分离微生物 培养 将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于370C温箱中培养24h；统计所长出的菌落数； 挑菌（不做） 将培养后所需要的单个菌落（要求是细菌菌落）分别挑取划线于平板上， 370C培养48h检查菌落是否单纯，也可以用显微镜涂片染色镜检是否是单一的微生物； 实验步骤——从土壤中分离微生物 菌落计数 计算相同稀释度的平均菌落数: 有较大片菌苔生长时,弃用,以无片菌苔生长的平皿计数; 若成片菌苔大小不到培养皿的一半,其余一半分布均匀,将此一半计数*2; 实验步骤——从土壤中分离微生物 菌落计数 选择平均菌落数在30~300间的平板: 只有一个符合此范围时,以该平均菌落数乘稀释倍数即为该样品中微生物总数; 有两个在30~300间时,按两者菌落总数比值决定:比值小于2,取平均;比值大于2,取较少的菌落总数; 实验步骤——从土壤中分离微生物 菌落计数 所有菌落数均大于300,取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数; 所有菌落数均小于30,取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数; 所有菌落数均不在30~300间,以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数; 结果与讨论 你所取的土壤中细菌数量级为多少？ 从你周围环境中微生物的观察,你认为无菌操作应注意什么? 说明饭前洗手,饭后刷牙的重要性; 在日常生活中如何讲究饮食卫生? 谢谢大家! * * 现代生物学导论实验 *