一株降解苄嘧磺隆光合细菌的分离鉴定及其降解特性-生态环境学报.docVIP

一株降解苄嘧磺隆光合细菌的分离鉴定及其降解特性 张松柏1,2，张德咏1,2，罗香文2，尹乐斌1，刘勇1,2*，程菊娥2，朱春辉2 1. 中南大学研究生院隆平分院湖南 长沙 410125；2. 湖南省植物保护研究所，湖南 长沙 410125 从农药厂工业废水和污泥中富集分离到一株能降解苄嘧磺隆（Bensulfuron methyl）的光合细菌PSB07-6，根据分离菌株的细胞形态结构、活细胞光吸收特征、生理生化特征以及系统发育分析将该菌初步鉴定为沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）。高效液相色谱法 HPLC 测定该菌降解光合细菌培养基中苄嘧磺隆的能力，在pH为6.5的光合细菌培养基中培养5 d，对350 mg·L-1苄嘧磺隆降解率达25.03％，添加回收率为105%~112%。降解特性研究结果表明，该菌能以苄嘧磺隆为唯一碳源和氮源，降解最佳条件为30 ℃、pH 6.5。 苄嘧磺隆；光合细菌；降解特性；生物修复中图分类号：X 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（200）0-1774-04通过农药的使用，来提高单位面积粮食产量是21世纪农业的重要举措之一。而杂草防除在农作物生产中则起着关键性的作用。磺酰脲类除草剂以其超高效性为农药的发展开辟了一个新天地，其单位面积用量极低，每公顷仅以克计，生物活性高，除草效果好，对敏感植物无药害[1,2]。但是磺酰脲类除草剂选择性强，对不同作物的敏感性差异很大，在其应用过程中遇到残留药害和抗性问题，许多国家和地区目前不得不暂时禁用某些此类除草剂[3]。 目前，国内外对于该类化合物在环境中消减的研究，大多集中在对其化学代谢及理化影响因素方面，对于微生物降解途径及化学物的生物降解性方面尚无系统研究[4-5]。 从废水和污泥中分离到一株能降解苄嘧磺隆的光合细菌PSB07-6，并对其降解苄嘧磺隆的特性进行了初步研究。该研究工作为利用光合细菌菌剂在苄嘧磺隆生物修复中的应用提供一定理论依据。 光合细菌分离培养基（PSB培养基），MM培养基，参考文献[6]，选择培养基：在光合细菌分离培养基中不加碳源和氮源，加入一定质量浓度的苄嘧磺隆；以上试剂均为分析纯。 w 10％苄嘧磺隆WP，浙江天一农化有限公司；w 98%苄嘧磺隆标样，天津东方绿色技术发展有限公司。苄嘧磺隆残留检测由湖南省植物保护研究所农药残留检测室检测，农药残留检测试剂均为色谱纯。 HPLC（Waters 600，USA），JEXL-1230透射电子显微镜（日本电子公司，日本）, 分光光度计（Tu-1901,北京普析通用仪器有限责任公司）。 1.2 降解菌的筛选 降解菌的筛选采用富集培养分离[7]，筛选到能耐受400 mg·L-1苄嘧磺隆的光合细菌,命名为PSB07-6。 检测各种生理生化指标[8]。 将活的细菌滴到具膜载网上，然后进行磷钨酸染色，TEM（transmission-scanning electron microscope）观察拍照。 取1.5 mL培养5 d的光合细菌培养液，8 000 r·min-1离心洗涤3次，用w 0.9％生理盐水重悬浮，分光光度计300~900 nm扫描。 细菌基因组提取采用上海生工生物工程技术服务有限公司UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒，步骤参见使用说明书。以所提的细菌总DNA为模板，细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增[9]，w 1％琼脂糖电泳，检测扩增片断的大小和特异性，上海生工生物工程技术服务有限公司测序。 将PSB07-6测得的16S rDNA序列在GenBank中利用blast进行比对，用ClustalW进行多序列联配，Mega 将菌液摇匀，取200 μL菌液，用流动相定容至5 mL，超声波提取20 min，过0.45 μm滤膜，待测；以浓度为0.2 mg·L-1的苄嘧磺隆标准样品作为标准，计算样品的残留量。 苄嘧磺隆残留测定利用Waters 600 HPLC进行，测定条件及过程参照文献[1,4,11,12]。流动相φ 0.25％乙酸：甲醇（35：65），流速0.8 mL·min-1，波长225 nm。 农药降解率的计算方法： 降解率（％）＝（1―C1/C0）×100 C1：降解菌处理5 d后苄嘧磺隆残留质量浓度，C0：对照处理5 d后苄嘧磺隆残留质量浓度。 图3 PSB07-6的系统发育树 Fig.3 Phylogenetic tree of PSB07-6，Micrococcus luteus was selected as the outgroup to root the tree. The numbers at each branch points indicated the percentage supported by bo