猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒.doc

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒 【产品名称】 通用名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒 英文名称：Diagnostic Kit for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus of RT-qPCR 【预期用途】 本试剂盒用于定性检测猪肺、扁桃体和脑等病灶组织样本中的猪繁殖与呼吸综合征病毒 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV 核酸。PRRSV感染可引起怀孕母猪流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎及断奶仔猪肺炎、生长迟缓，且常发生呼吸困难，伴发细菌混合感染，在发病过程中会出现短暂性的两耳皮肤紫绀。本试剂盒适用于临床上对猪繁殖与呼吸综合征病毒的辅助诊断。 【检验原理】 本试剂盒利用实时荧光PCR检测技术，以猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组的高度保守序列为靶区域，设计特异性引物和TaqMan荧光探针，通过一步法RT-PCR扩增，在PCR扩增中监测荧光的变化，从而实现对猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸的快速检测。 【试剂盒主要组成成分】 名称 贮存温度 平衡液BL 室温（A盒） 缓冲液RG 缓冲液RD 缓冲液RW（使用前加入无水乙醇） RNA洗脱液 RNase-free吸附柱和收集管 RNase-free离心管 实时荧光8联排管 扩增反应液 -20℃（B盒） 酶系 阴性对照 阳性对照 【适用仪器】 ABI7000、ABI7300、ABI7500、ABI7900、MX3000P、MX3005P、iCycleriQ4、iCycleriQ5、MJ-chromo4、Lightcycler R480、slan等全自动荧光定量PCR仪，具备检测520nm波长的荧光通道即可。 【检验方法】 一、样品制备： 1. 样品采集：病死或扑杀的猪肺、扁桃体和脑等病灶组织。置于50%甘油生理盐水中，2~8℃保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。） 2. 样品处理：每份样品分别处理 2.1 组织样品处理：每份组织随机从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，后转移至1.5mL灭菌离心管中。 2.2 全血样品处理：待血凝后取血清200μL，置1.5mL灭菌离心管中。 二、操作步骤： 1、核酸提取（A盒） 1.1吸附柱活化：向吸附柱中加入500μL平衡液BL，室温静置5min，室温12000rpm离心30~60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 1.2取已处理的样品，分别加入600μL缓冲液RG，温和的上下颠倒混匀6~8次，室温静置5min；2~8℃下5000rpm离心1~2min，取400μL上清转入新的RNase-free离心管。 1.3加入200μL的无水乙醇，立即的上下颠倒混匀，全部转入吸附柱，静置1~2min；2~8℃下12000rpm离心30~60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 1.4向吸附柱中加入500μL缓冲液RD，室温静置2min，2~8℃下12000rpm离心30~60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 1.5向吸附柱中加入800μL缓冲液RW，2~8℃下12000rpm离心30~60s，弃掉收集管中的废液。 1.6将吸附柱重新放回收集管中，2~8℃下12000rpm离心2min，将吸附柱中残余的液体去除。 1.7将吸附柱置于一个干净的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60μLRNA洗脱液，室温放置2min。 1.8室温12000rpm离心1min，离心管中液体即为模板RNA，-20℃保存或直接进行下游实验。 2.RT- PCR扩增（B盒） 2.1 配液（在试剂准备区进行）：取出扩增反应液，室温融化后充分混匀，短暂离心，并按反应个数分别取反应液和酶按照以下配比配制反应液：（注意应考虑有阳性对照和阴性对照甚至空白对照） 试剂 扩增反应液 酶系 用量（反应个数为ｎ） 17.5μL×ｎ 0.3μL×ｎ 反应液配制时应充分混匀，短暂离心，按17.5μL/管分装到PCR反应管中，转移至样本处理区。 2.2 加样（在样本处理区进行）：分别加入2.5μL步骤二中处理好的样本、阴性对照、阳性对照，盖好管盖，转移至核酸扩增区。 2.3 RT-PCR扩增检测（在核酸扩增区进行） 将反应管置于全自动荧光定量PCR仪样品槽中，设置扩增反应条件为：48℃ 10min，94℃ 2min；然后进行94℃ 10s，58℃ 35s，40个循环。荧光通道选FAM，在每个循环的58℃时收集荧光。如果使用ABI系列荧光PCR仪，设置扩