王镜岩-生物化学I-第14章 核酸的物理化学性质—第15章 核酸的研究方法.ppt

一、核酸的变性(denaturation) 变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。 1. 引起核酸变性的因素 （1）温度；加热到80～100℃ （2）酸碱度改变 （3）化学试剂：尿素 、甲醛 2. 核酸变性的特点 （1）一系列物化性质也随之发生改变 ：紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密度升高，酸碱滴定曲线改变等 （2） 变性作用发生在一个很窄的温度范围内 。 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在82—95℃之间 3. 影响Tm值的因素 (1) DNA的均一性 。越均一，DNA熔解温度发生在一个很窄的温度范围之内 (2) G-C之含量 。G-C对含量越多，Tm值越高 (3) 介质中的离子强度 。一般说在较高的离子强度时，DNA的Tm值较高，而且熔解过程发生在一个较小的温度范围之内。 二、复性 (renaturation) 变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，这过程称复性 1. DNA复性的特点： （1）许多物化性质又得到恢复 （2）将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性 （3）DNA的片段越大，复性越慢。 （4）DNA的浓度越大，复性越快。 2. Cot l/2 衡量复性反应的速度快慢的指标 Co为变性DNA复性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示， t为时间，以秒表示， Cot l/2表示复性一半的Cot值 在DNA浓度相同的情况下， Cot l/2与基因组的大小成正比 三、核酸的杂交 (hybridization) 1. 定义： 将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则复性时，会形成杂交DNA分子。 DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。是分子生物学和分子遗传学的研究中应用极广的技术。 2. 常见杂交的类型 （1）Southern blotting （2）Northern blotting （3）Western blotting （1）. Southern印迹杂交 将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段 由于它是由E．Southern于1975年首先设计出来的，故叫做Southern DNA印迹转移技术。 （2）Northern blotting 1979年，发展出了一种新的方法，将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由此可见，这种方法同DNA印迹杂交技术十分类似 （3）Western blotting 将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种技术叫做Western蛋白质杂交技术。 第15章 核酸的研究方法 制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用 一、核酸的分离、提纯和定量测定 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl 去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。 DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇 （一）DNA分离纯化 制备RNA时，最重要的是使RNase灭活： ①所有容器都要经过高温处理，不能高温高压的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。 ②加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活； ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin) （二）RNA的分离 （三）核酸含量的测定 2、定糖法 RNA：核糖→ 糠醛→ →绿色物质（670-680nm） DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm） 苔黑酚/地衣酚 浓HCl 浓硫酸 1、紫外吸收法 1个A～50μg/ml 双链DNA ～40μg/ml RNA或单链DNA 3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸 4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比 纯DNA 比值1.8，＜ 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染 （四）、核酸纯度的测定 OD260／OD280 二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同