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ICAM―1K469E基因多态性与IS相关性研究 　　摘要： 目的： 探讨细胞间黏附分子-1（ICAM-1）K469E 基因多态性与缺血性脑卒中（IS）遗传易感性的关系。方法： 应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测、分析病例与对照两组间ICAM-1 K469E基因型及等位基因频率分布的差异。结果： IS病例组和对照组的ICAM-1K469E 基因各等位基因频率、基因型分布相比均无统计学差异（P0.05 ）。结论： 衡阳市人群中IS 遗传易感性与ICAM-1 K469E 基因无明显关联。 　　关键词： 细胞间黏附分子-1；基因多态性； 缺血性脑卒中 　　资助项目：2012年衡阳市科技计划一般项目（项目编号）2012KS22 　　脑卒中是严重威胁人类的三大疾病之一，具有发病率高、患病率高、致残率高、复发率高的特点，给社会和家庭带来沉重的负担。脑卒中患者中缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）占59.8%[1]。迄今为止，关于IS的发病机理还远未阐明，而随着分子生物学技术的发展，IS相关基因的定位和识别已成为研究的热点。研究发现细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）在动脉粥样硬化的形成中发挥着十分重要的作用，其基因多态性与IS的关系也倍受研究者关注[2]。但是ICAM -1 K469E基因多态性是否为IS的危险因素尚难肯定。而且由于IS是多因素、多基因相互作用的疾病，在促进IS发生的过程中，ICAM-1 K469E基因多态性与IS其他危险因素之间是否存在交互作用，国内外亦未见此类报道。本研究采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，检测ICAM-1 K469E基因多态性在病例组和对照组中的频率，同时应用多因素统计方法，分析其在IS发病中的作用，为我国开展脑血管疾病的预防和基因治疗提供科学依据。 　　1 资料与方法 　　1.1 临床资料 IS病例来源于2013年5 月～2014年11月南华大学附属第一、第二医院神经内科，对照来源于同一医院其他患者或健康体检者。采用1：1比例配对，病例、对照各确定为220例。对照组与病例组性别、民族相同，年龄相差不大于5岁，职业、经济状况、居住环境等比较无统计学意义，具有可比性。所有患者均无血缘关系。均经神经内科专家诊断，符合该病诊断标准，全部研究对象均取得知情同意。排除糖尿病、恶性肿瘤、肝肾功能不全、甲状腺疾病、接受器官移植、严重营养不良等疾病。 　　1.2 主要试剂 PCR 引物序列由上海生物技术有限公司设计；Taq 酶系、dNTP（美国 promega公司）；红细胞裂解液（德国BAG公司）。 　　1.3 检测方法 　　1.3.1 标本收集与基因组DNA提取 取每例患者和正常对照组外周静脉全血3m1 分别加入EDTA抗凝管中，采用酚氯仿法从外周静脉全血中提取人全基因组DNA。 　　1.3.2 IC M-1K469E基因扩增 上游引物：5，-GGGCCAGGAGCACTCAA G-3，，下游引物：5，-CGGTGAGGATTGCATTAGGT-3，。PCR体系总体积为40ul，包括DNA模板2ul、2mmoL/LdNTP 4ul、PCR 缓冲液4ul，上、下游引物 Taq DNA聚合酶0.4ul。PCR 反应条件：95℃预变性15min，94℃ 30s、56℃ 60s、72℃60s， 共35循环，再于72℃延伸7min。3%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 　　1.3.3 连接酶检测反应 （LDR ）及测序仪电泳 对获得的PCR 扩增产物进行多重LDR，通过测序仪电泳读取检测结果 。 　　1.4 统计学方法 所有数据统计均由SPSS13.0统计软件包完成。基因型频率的分布经 Hardy-Weinberg 平衡检验。ICAM-1基因型、等位基因计数用直接计数法，并计算基因型及等位基因频率，组问比较采用χ2检验。以 P ≤0. 05 为差异有统计学意义 。 　　2 结果 　　2.1 ICAM-1K469E等位基因测定 应用 Gene-mapper进行数据分析分出3种基 因型，分别为ICAM-1AA 型（数据分析图上于82 处出现一波峰，A等位基因纯合子）、A/G 型（数据分析图上于82、84 处出现2个波峰，杂合子）、G G 型（数据分析图上于84处 出现一个波峰，G等位基因纯合子）。 　　2.2 ICAM-1 K469E 基因型和等位基因频率分布对照组和IS病例组 ICAM-1 K469E 基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡（P 0.05）。对照组AA 型、GG 型、AG 型K469E基因型频率分别为 63.64%（35/5