基于Profinity eXact系统的可溶性egfp表达和纯化.docVIP

基于Profinity eXact系统的可溶性egfp表达和纯化 　　摘要：为研究Profinity eXact系统在蛋白表达及纯化过程中的效果，利用PCR扩增绿色荧光蛋白基因egfp，定向克隆至表达栽体pPAL7上，转化BL21（DE3），荧光显微镜下观察诱导后的重组菌；取超声破碎的上清挂柱纯化，紫外下检测纯化后egfp发出荧光的特性，Western blot分析其免疫反应性。结果表明：诱导后的重组菌pPAL7-egfp/BL21（DE3）在紫外光下能够发出绿色荧光；一步纯化后的egfp蛋白同样也能在紫外激发下发出绿色荧光，同时egfp蛋白能和特异性抗体结合，具有良好的免疫反应性。实验结果说明Profinity eXacl系统对于可溶性蛋白的表达和纯化，方法操作简单、快捷，具有很好的应用价值。 　　关键词：纯化；Profinity eXact系统；egfp蛋白；原核表达 　　中图分类号：Q789 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847（2014）04―0310-05 　　蛋白纯化作为后基因组学时代研究蛋白质功能、结构最常用的手段，已被国内外研究人员所广泛运用。随着纯化技术的发展，逐渐形成了今天运用最为成熟和普遍的亲和纯化系统，如常用的以GST、Flag、His标签为基础的亲和纯化，即将目的蛋白与纯化标签进行融合表达，通过与标签结合的层析介质来纯化目的蛋白。然而，标签蛋白作为融合蛋白的一部分，其大小、带电荷性可能对目的蛋白的表达、成熟、分泌造成影响，其免疫原性可能对目的蛋白的功能研究带来屏障。因此，对于蛋白质的结构、功能等研究，我们期望纯化出不含标签的目的蛋白，以避免亲和标签可能存在的干扰。然而，如果在亲和纯化后，再对标签进行剪切则使得下游操作更为复杂。 　　美国Bio-Rad公司开发的Profinity eXact纯化系统是一套新型的亲和层析表达纯化工具，包含了表达载体和纯化介质，借助融合表达的亲和标签与同化在填料上突变的丝氨酸蛋白酶结合，并在卤素离子（F-或Cl-）或者叠氮离子（N3-）的作用下能精确地诱发亲和标签和目的蛋白之间的剪切，从而导致Profinity eXact标签被固定的蛋白酶滞留在纯化介质上，仅预期的目的蛋白从层析柱上洗脱，虽然该洗脱蛋白的N端存在多克隆位点处的一两个氨基酸，但基本不影响洗脱蛋白的下游应用。为了验证该系统，本文将egfp基因作为工具，通过该系统实现了蛋白egfp的高效表达，并获得了不带标签的功能性高纯度egfp蛋白。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌株与质粒 　　原核克隆宿主E.coli DH5α；原核表达宿主E.coli BL21 （DE3）；质粒pEGFP-N2购自美国Clon-tech公司；表达质粒载体pPAL7购自美国Bio-Rad公司。 　　1.1.2试剂与纯化柱 　　DNA聚合酶、dNTP、DNA Maker DL 5000购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性核酸内切酶Spe I，Xho I及T4 DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；一抗：鼠抗GFP单抗（天德悦北京生物科技有限公司），HRP标记的二抗：羊抗鼠IgG抗体（美国KPL公司）；质粒小量快速提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自北京庄盟生物技术有限公司；氯仿、乙醇、氟化钠等试剂均为国产分析纯；1mL空填装柱购自碧云天生物科技有限公司；Profinity eXact protein purification填料购自美国Bio-Rad公司。 　　1.1.3培养基及缓冲液 　　LB培养基：5g酵母粉、10g蛋白胨、10g氯化钠、蒸馏水1000mL （固体培养基添加2%的琼脂），121℃灭菌30min。 　　氨苄抗生素的浓度为：100mg/L。 　　平衡缓冲液：0.1mol/L磷酸钠，pH7.2；洗脱缓冲液：0.1mol/L磷酸钠，0.1mol/L氟化钠混合液，pH7.2；再生缓冲液：0.1mol/L磷酸。 　　1.2方法 　　1.2.1目的片段扩增及重组质粒构建 　　以pEGFP-N2为模板，设计引物（表1），并在上游引物5端处添加酶切位点Spe I及保护性碱基，下游引物5端处添加终止密码子TAA、酶切位点Xho I及保护性碱基，PCR扩增绿色荧光基因egfp。PCR扩增条件：预变性温度及时间为93℃ 10min；解链温度及时间为93℃ 30s；退火温度及时间为55℃ 30s；延伸温度及时间为72℃40s；循环数为35；最后72℃ 10min。扩增得到的产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收，再通过Spe I和Xho I双酶切、胶回收得到具有黏性末端的目的片段。提取质粒pPAL7，同样用Spe I和Xho I进行双酶切、胶回收得到具有黏性末端