基于巯基―烯烃点击化学的聚丙烯酰胺型亲水作用色谱固定相的制备.docVIP

基于巯基―烯烃点击化学的聚丙烯酰胺型亲水作用色谱固定相的制备 　　摘 要 采用巯基-烯烃点击反应制备了一种新型聚丙烯酰胺键合烯基修饰硅胶的亲水色谱固定相。丙烯酰胺与二硫代苯甲酸苄酯通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）反应合成聚合物。在甲苯中，3-异氰酸酯丙基三甲氧基硅烷、丙烯胺和吡啶反应后，再与硅胶反应制备烯基修饰硅胶（EUS）。在甲醇中，以2，2-偶氮二异丁基脒盐酸盐为引发剂，被硼氢化钠还原的聚丙烯酰胺与EUS于55℃反应48 h，键合上巯基活化的聚合物。利用元素分析和红外光谱的方法对固定相TE-UPAM（Thiol-ene urea polyacy （amide））进行表征，含碳量与EUS相比有所增加，在1636和1570 cm-1处存在多重酰胺键红外特征峰。考察了流动相中水含量、盐浓度和pH值的变化对极性化合物保留时间的影响。结果表明，保留时间随水含量的增加而减小； 中性和碱性化合物保留时间随盐浓度的增大而延长，在pH 3.3～4.8范围内，碱性化合物的保留时间随pH的降低而缩短，均与酸性化合物相反。固定相TE-UPAM在亲水模式下与传统硅胶固定相比较，更好地分离了7种核苷和碱基，再通过对寡糖的分离，表明此固定相分离极性化合物的巨大潜力。 　　关键词 可逆加成-断裂链转移； 聚丙烯酰胺； 巯基-烯烃点击化学； 亲水作用色谱 　　1 引 言 　　亲水作用色谱（Hydrophilic interaction liquid chromatography， HILIC）作为一种分离极性化合物的液相色谱模式，最早由Alpert于1990年提出[1]，主要特征是使用类似于正相色谱的极性固定相和水/有机溶剂（通常是乙腈）的流动相。HILIC固定相的键合相为亲水性的极性基团。随着HILIC的快速发展，其固定相也日益丰富。其中，一类为小分子键合相，如二醇基、氰基、氨基、酰胺、半胱氨酸、麦芽糖等[2～5]； 另一类为聚合物键合相，如聚琥珀酰亚胺型PolyHydroxyethyl A，PolyCAT A和PolySulfoethyl A等[6]，聚磷酸胆碱型KS-polyMPC[7]和聚甜菜碱型[8]。目前，制备聚合物键合相主要有“从表面接枝（Grafting from）”和“接枝到（Grafting to）”两种方法。“从表面接枝”方法[9]是将反应活性种以化学键的形式接枝到基体表面，然后在表面引发单体接枝聚合。该方法中分子体积小，易扩散至基体表面发生链增长反应，键合密度高，但得到聚合物的分子量分布较宽，均匀性差。“接枝到”方法[10]是将预合成的聚合物通过具有反应活性的末基或侧基与功能化表面的化学反应接枝到基体表面。该方法可较容易地控制聚合物的分子量及其分布，键合相有较好的规整度，但由于分子体积较大，存在空间位阻效应，使键合效率较低，键合量受限。因此，需要高效反应来解决该问题。 　　2001年，Sharpless首次提出点击化学（Click chemistry）[11]的概念。Thiol-ene点击反应[11～13]与传统的叠氮-炔基点击反应[11，14]相比，具有无金属催化、反应效率高、操作简单、条件温和等优点。近年来，Thiol-ene在高分子化学、生物学和有机化学中的应用越来越广泛[15]。 　　本研究采用Thiol-ene点击化学方法，将亲水性的聚丙烯酰胺“接枝到”烯基修饰的硅胶表面，制备了一种HILIC固定相，在亲水色谱模式下进行评价和应用研究。通过可逆加成-断裂链转移（Reversible addition-fragmentation chain transfer， RAFT）反应[11]合成聚丙烯酰胺。RAFT是Rizzardo于1998年提出的一种可控活性自由基聚合方法，可以有效控制聚合物分子量及其分布。本研究中，RAFT试剂引入的硫代酯被硼氢化钠还原成巯基[15]，与硅胶表面的烯基发生Thiol-ene反应，实现聚丙烯酰胺的表面键合，使RAFT与Thiol-ene很好地结合。通过元素分析和红外光谱的方法表征，采用一系列极性化合物评价色谱性能，并选用碱基、核苷和寡糖探究TE-UPAM的应用潜力。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　材料表征所用仪器包括Nicolet 20 DXB红外光谱仪（Madison， WI， USA），Vario EL III 元素分析仪（Elementar， Germany），Bruker DSX 300 核磁共振仪（300 MHz， 7.0 T， Karlsruhe， Germany）和Malvern Zetasizer Nano-ZS90电位测定仪（Malvern， UK）。 　　色谱评价所用仪器为Waters 2695高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样