抗微生物药物和敏感性试验课件.ppt

耐药基因检测 此方法是很有发展前景的方法，它具有快速的优点，能在几小时出报告结果，常用方法 1、PCR法 2、PCR-RFLP，即限制性片段长度多行性分析。 3、PCR-SSCP即单链构象多态性分析。 4、PCR一线性探针分析 。 5、生物芯片技术 。 6、自动DNA测序等。 抗生素治疗失败的主要原因 病人相关原因 依从性差 不适当给药途径 免疫抑制 病灶 药物原因 给药剂量与方式不当 药效学考虑欠妥 药物失活 微生物相关的原因 病原确立错误 治疗中出现耐药 抗菌活性不足 接种效应 其他原因 非感染（误诊） 基础疾病 * 当在临床微生物实验室进行药物敏感试验时应该记住以下四点 1. 测定那些可能导致感染细菌的药物敏感性试验 2. 应用标准化的药敏试验方法 3. 测定并报告对人体和感染部位合适的抗菌药物 的药敏试验的结果 4.质量控制以确保药敏试验的正确性 第三节细菌耐药机制及耐药性检测 细菌耐药性（ Bacterial resistance） 指病原体对反复应用的化学治疗药物敏感 性降低或消失的现象。 金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药趋势 1 细菌产生破坏药物结构的酶 2 改变药物作用的靶位 3 抗生素渗透障碍 4 药物主动外排系统 一、细菌耐药性产生机制 1、细菌产生破坏药物结构的酶 （一） 水解酶-β-内酰胺酶 是以β-内酰胺类抗菌药物为水解底物的多种同类型的降解酶。包括广谱内酰胺酶、超广谱酶β-内酰胺（ESBLs）、金属酶、AmpC酶等 细菌产生的β-内酰胺酶可特异性打开β-内酰胺环，使其完全失去抗菌活性。 ESBLs阳性菌：对所有β-内酰胺类药物耐药 （二）钝化酶产生 1.氨基糖苷类钝化酶 2.氯霉素乙酰转移酶 3.红霉素和其他灭活酶 （三）修饰酶 1.乙酰转移酶AAC 2.核苷转移酶ANT 3.磷酸转移酶APH  Producing an Enzyme to Destroy or Inactivate the Antibiotic 例：链霉素作用靶位菌体核糖体30S亚基的结构改变。 2、改变药物作用的靶位 3、抗生素渗透障碍 微孔蛋白 例：oprD2基因发生缺失突变时，微孔缺失，对亚胺培南耐药。 4、药物主动外排系统 外排系统由三个蛋白组成，即转运子、附加蛋白、和外膜蛋白，三者缺一不可，又称三联外排系统 外排系统由三个蛋白组成，即转运子、附加蛋白、和外膜蛋白，三者缺一不可，又称三联外排系统 二、特殊耐药菌检测 （一）?-内酰胺酶检测 原理： β-内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于G+球菌菌体外，G-杆菌周浆间隙。 检测方法：常用头孢硝噻吩纸片法 头孢硝塞吩纸片法 头孢硝塞吩的内酰胺环被β-内酰胺酶打开， 基质由黄色变为红色。 G+菌直接取培养物 G-菌取细菌裂解液 （二） 超广谱?-内酰胺酶检测 筛选试验：头孢泊肟≦ 17mm、头孢他啶（10ug/片）抑菌圈≦22mm或头孢曲松≦ 25mm、氨曲南、头孢噻肟（30ug/片）≦27mm 确认试验： 头孢他啶（30ug/片）、头孢他啶/克拉维酸（30ug/10ug）和头孢噻肟（30ug/片）、头孢噻肟/克拉维酸（30ug/10ug）两组，加克拉维酸比不加的抑菌圈增大≧5mm为阳性。 （三）AmpC酶检测 AmpC酶初筛试验 采用纸片扩散法进行 AmpC酶的表型筛选,凡纸片扩散法头孢西丁抑菌圈直径 ≤18 mm,即认为是可能产 AmpC酶菌株。 AmpC酶确证试验 将 0.05麦氏单位大肠埃希菌 (ATCC 25922)均匀涂布于 MH琼脂平板,待表面干燥后,在平板中央贴一头孢西丁 纸片,用环挑取2～3个过夜培养的待检菌落,并稍用力沿纸片边缘划向平板边缘,置35℃ 孵箱培养18 h,观察待检菌周围头孢西丁抑菌圈的变化,如果抑菌圈变化≥2 mm,则提示产AmpC酶阳性。质控菌株：阴沟肠杆菌O29M作为产AmpC酶的阳性质控菌株,大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照菌。 （四） 碳青霉烯酶的检测 筛选试验 厄他配南 19 — 21mm 美罗配南 16 — 21mm 以上抑菌圈直径指示可能产碳青霉烯酶，即使它们在现行的敏感判读标准范围内。要予确证就作改良 Hodge 试验。 改良Hodge试验 (MHT) 检查MHA平板上的测试菌株或QC菌株的划线与抑菌圈边缘交叉部分的增强性生长（见插图1和2）。 增强性生长＝产碳青霉烯酶阳性。 无增强性生长＝产碳青霉烯酶阴性。 (1) 在肉汤或盐水中准备0.5号麦氏标准浊度的大肠埃希菌 ATCC25922（指示菌）菌悬液（用直接菌落悬液法或