甲基转移酶对鼻咽癌细胞中DLC―1基因表达的影响.docVIP

甲基转移酶对鼻咽癌细胞中DLC―1基因表达的影响 　　摘要：肝癌缺失基因-1（deleted in liver cancer-l，DLC-1）在多种肿瘤中呈现表达缺失或表达下调，这种异常表达主要与由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases.DNMTs）参与的启动子区异常甲基化有关。RT-PCR结果显示DLC-I在永生化鼻咽上皮细胞NP69和干扰DNMTs的5-8F细胞中的表达水平较未干扰的鼻咽癌细胞明显升高。甲基化特异性PCR（methylation-specifiC PCR， MSPCR）结果则表明DLC-1启动子区在表达下调或缺失的鼻咽癌细胞中均存在异常高甲基化，而干扰DNMTs后5-8F细胞中DLC-l启动子区甲基化状态被逆转，其中特异性干扰DNMT1后效果略为显著，提示DNA甲基转移酶活性对于鼻咽癌中DLC-1启动子区甲基化水平具有重要的调控作用，而DNMT1的调控作用更为突出。 　　关键词：DNA甲基转移酶（DNMTs）；肝癌缺失基因-1（DLC-1）；甲基化；RNA干扰 　　中图分类号：Q786 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847（2014）04-0292-07 　　DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的催化作用下，将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基添加在DNA分子中CpG二核苷酸的胞嘧啶碱基上。在哺乳动物中，甲基化转移酶主要有4个成员，即DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。DNMT1主要在DNA复制和修复中维持其甲基化，而DNMT3则是从头合成甲基化酶，使得原来没有甲基化的DNA甲基化，包含了DNMT3A、DNMT3B和一个调节蛋白DNMT3L，对于富含CpG片段的DNA，DNMT3A甲基化效率不高，但是它显示出比其他甲基化酶更高的准确性，有文献证明DNMT3A与单拷贝基因的甲基化有关。相反，DNMT3B却能快速甲基化富含CpG的片段，而DNMT3L因缺乏起催化作用的亚基，因而其本身并不具备甲基化酶活性，但能作为调节蛋白，协助DNMT3A和DNMT3B，共同进行甲基化作用。 　　肝癌缺失基因一l（deleted in liver cancer-l，DLC-1）是由Yuan等于1998年通过代表性差异分析（representational difference， analysis， RDA）方法首次从肝脏组织中克隆获得，是GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）家族中的一员，通过激活Rho家族蛋白自身GTP酶活性而发挥作用。DLC-1基因在正常组织中广泛表达，但在肝癌、胃癌、大肠癌、小细胞性肺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤等多种肿瘤中呈现表达缺失或表达下调，而且这种异常表达主要与等位基因杂合性丢失和启动子区异常甲基化有关，而基因突变对于DLC-l的影响很小。在肝癌、乳腺癌、非小细胞性肺癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤等肿瘤细胞中恢复表达DLC-1，发现该基因不仅能抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡，而且还参与抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。 　　为进一步研究DNA异常甲基化在DLC-1表达失活中的作用，考察DNMTs对DLC-1启动子区异常甲基化的影响，我们在本研究中将采用RNAi技术，特异性地干扰鼻咽癌5-8F细胞内DNMT1、DNMT34和DNMT3B后，分析DLC-1的启动子甲基化状态和表达情况。 　　1材料及方法 　　1.1材料 　　1.1.1细胞系 　　HNE1、HNE2、HNE3、CNE2为鼻咽低分化鳞状细胞癌细胞系；CNE1为鼻咽高分化鳞状细胞癌细胞系；5-8F、6-10B为鼻咽低分化鳞状细胞癌细胞系SUNE-1亚株，5-8F细胞系具有高成瘤、高转移能力；6-10B细胞系则具有成瘤，不转移特性；NP69为SV40T永生化鼻咽上皮细胞系；以上细胞系均为我所保存，于RPMI1640+1O%新生小牛血（newborn calf serum， NCS）的培养基中，37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，呈上皮样、贴壁生长。 　　1.1.2主要仪器 　　VDS紫外凝胶摄像仪购白美国Pharmacia公司；实时荧光定量PCR仪购自美国Bio一Rad公司；光学显微镜和倒置显微镜购自日本Nikon公司；高速冷冻离心机及常温离心机购自上海赛特离心机公司；-80℃冰箱、二氧化碳生化培养箱购自美国Forma Scientific公司；超净工作台购自江苏苏净集团安泰公司；电泳仪和电泳槽购自北京六一仪器厂。 　　1.1.3主要试剂/试剂盒 　　RPMI 1640、新生小牛血清、TRIzol试剂、琼脂糖购自美国Invitroge