液相色谱串联质谱法同时检测DNA中3_甲基腺嘌呤和3_乙基腺嘌呤.docVIP

液相色谱串联质谱法同时检测DNA中3_甲基腺嘌呤和3_乙基腺嘌呤 　　摘要利用阳离子交换固相萃取柱（Waters Oasis MCX）富集净化DNA样品，建立了液相色谱串联质谱（LCMS/MS）同时检测DNA中3甲基腺嘌呤（N3MeA）和3乙基腺嘌呤（N3EtA）的方法。采用氘代3甲基腺嘌呤（d3N3MeA）和氘代3乙基腺嘌呤（d5N3EtA）为内标； 进样量3 μL，分析时间为13 min；亲水相互作用色谱柱（Waters XBridge HILIC）进行液相分离，流动相为10 mmol/L甲酸铵乙腈溶液（5∶95， V/V， pH=4.0），流速250 μL/min；质谱条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压：5500 V， 雾化气： 369 Pa， 气帘气：185 Pa， 电离温度： 400 ℃，驻留时间： 40 ms。本方法对N3MeA和N3EtA的检出限分别为0.043和0.007 μg/L，方法回收率为87.8%～103.0%。采用本方法检测了卷烟烟气粒相物暴露的DNA中N3MeA和N3EtA含量。结果表明，卷烟烟气粒相物暴露后的小牛胸腺DNA中3甲基腺嘌呤和3乙基腺嘌呤可被本方法定量检出。1引言 　　卷烟烟气中包含超过5000种化学物质＼[1，2＼]，其中包含致突变并可导致DNA发生烷基化损伤的物质＼[3＼]。这些物质可与DNA反应形成烷化类的DNA加合物，已经成为多学科的研究热点＼[4～7＼]。烟气中致癌性的烷化试剂与DNA反应的主要位点是鸟嘌呤的N7位和腺嘌呤的N3位，DNA反应后形成7烷化鸟嘌呤和3烷化腺嘌呤＼[8，9＼]。3烷化腺嘌呤中比较重要的是3甲基腺嘌呤（N3methyladenine，N3MeA）＼[10＼]、和3乙基腺嘌呤（N3ethyladenine，N3EtA）＼[8＼]，其结构式见图1。3甲基腺嘌呤在3烷化腺嘌呤中突变性最强，并且具有基因毒性，3乙基腺嘌呤虽然不具有基因毒性，但是在经体内烷基糖基酶的修复后会在DNA中产生脱嘌呤的位点，这些位点被认为是引起基因突变并导致癌症的主要因素＼[11～16＼]。因此，DNA中的3甲基腺嘌呤，3乙基腺嘌呤被认为是卷烟烟气接触后DNA发生烷基化损伤的标志物＼[17，18＼]。准确测定DNA中3甲基腺嘌呤和3乙基腺嘌呤，可用于评估DNA受到的破坏程度及可能的致癌风险＼[19＼]。 　　[TS（]图13甲基腺嘌呤和3乙基腺嘌呤结构式 　　Fig.1Structures of N3methyladenine （N3MeA） and N3ethyladenine （N3EtA） [HT5][TS）] 　　目前，DNA中3烷化腺嘌呤的检测方法有气相色谱质谱法（GCMS）＼[8＼]，该方法前处理比较繁琐，需要化学衍生化，并且灵敏度低和专一性不强；酶联免疫法（ELISA）解决了3烷化腺嘌呤检测中的专一性问题，但是操作过程繁琐，结果稳定性较差＼[20＼]。液相色谱串联质谱技术因其具有灵敏度高、选择性好、操作简便、分析结果稳定可靠的特点，成为DNA加合物研究中的理想方法＼[21，22＼]。Hu 等首次报导了一种在线固相萃取结合液相色谱串联质谱同时分析DNA中7甲基鸟嘌呤、3甲基腺嘌呤和O6甲基鸟嘌呤的方法＼[23＼]，该方法检测7甲基鸟嘌呤、3甲基腺嘌呤和O6甲基鸟嘌呤的运行时间为12min。目前，同时检测DNA中3甲基腺嘌呤和3乙基腺嘌呤的液相色谱串联质谱方法还未见报道。 　　本实验建立了一种同时测定DNA中3甲基腺嘌呤、3乙基腺嘌呤的液相色谱串联质谱方法。本方法灵敏度高，稳定性好。利用本方法研究了卷烟烟气粒相物暴露后，DNA中3甲基腺嘌呤和3乙基腺嘌呤的含量。本方法可用于临床上评估烷基化试剂暴露后DNA的损伤程度。 　　2实验部分 　　2.1仪器、试剂与材料 　　1200快速液相色谱仪（美国安捷伦公司）配备G1367D自动进样器、G1312B二元溶剂泵、G1316B柱温箱； API 5500 三重四级杆串联质谱仪（美国加州应用生物系统公司），配备电喷雾电离源（ESI）； 数据采集与处理在Analyst 1.5.1软件上实现。RH20吸烟机（德国伯格瓦特公司）。 　　氘代3甲基腺嘌呤（d3N3MeA）、氘代3乙基腺嘌呤（d5N3EtA）、3甲基腺嘌呤、3乙基腺嘌呤（纯度≥98%，加拿大Toronto Research Chemical公司）； 甲醇、乙腈、氨水、乙酸乙酯和甲酸铵（美国TEDIA有限公司），DMSO（上海安普公司），所有的试剂均为色谱纯，实验中所用的水为超纯水。OASIS MCX 6cc固相萃取小柱（500 mg，6 mL，Waters公司）。3R4F标准参比卷烟购自美国肯塔基大学。 　　2.2.3标准工作溶