重组胶原蛋白多肽在大肠杆菌中的表达优化.docVIP

重组胶原蛋白多肽在大肠杆菌中的表达优化 　　摘要:以Ⅵ型人胶原蛋白A2链基因为模板,PCR扩增得到目的基因CP6,构建了重组胶原蛋白表达载体,然后筛选高效表达的宿主菌,检测重组质粒的不稳定性以及对重组菌培养条件进行优化。结果表明,重组胶原蛋白在Rosetta(DE3)中表达量相对最高,重组质粒稳定性也较高。较佳的表达条件为接种量4%或5%,37 ℃、200 r/min培养至OD600 nm为0.7时,加入0.5 mol/L IPTG,培养5 h,并且纯化的重组蛋白与小鼠抗人COL6A2的单克隆抗体有特异性反应。 　　关键词:胶原蛋白多肽;大肠杆菌(Escherichia coli);表达;优化 　　中图分类号:Q812文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)10-2443-05 　　 　　Optimizing Expression of Recombinant Collagen Peptide in Escherichia coli 　　 　　WU Ming1,2,GUO Li-quan1,CHEN Guang3 　　(1.Key Laboratory of Grain and Oil Processing of Jilin Province,Jilin Business and Technology College,Changchun 130062,China;2.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China; 　　3.School of Life Sciences,Jilin Agricultural University,Changchun 130000,China) 　　 　　Abstract:Designed primers to obtain the target gene(CP6) fragment through PCR,the template contained the protein polypeptide gene of Ⅵ type human collagen,and constructed the recombinant plasmid,and then screened the host bacteria of high efficient expression,detected the instability of recombinant plasmid,as well as optimized the culture conditions.The results showed that the best host bacterium was Rosetta(DE3) and the recombinant plasmid has higher stability. The optimal expression conditions were inoculum of 4% and 5%,37 ℃,200 r/min,cultured to OD600 nm 0.7 and added 0.5 mol/L IPTG to the culture medium,and then cultured 5 h. Western blotting showed that the expressed protein could specifically bind with human monoclonal antibody COL6A2. 　　Key words:collagen peptide;Escherichia coli;expression; optimization 　　 　　基金项目:2014年吉林省教育厅项目;吉林省科技厅青年基金项目(20140520145JH);吉林省2012年博士后科研项目启动项目 　　 　　 胶原蛋白多肽是运用链酶法水解对胶原蛋白进行提取,将其水解成可溶解性的水解胶原蛋白。胶原蛋白多肽的功能与胶原蛋白有很多不同,并涉及到生物体内多种细胞功能的活性物质[1]。目前,研究者已经发现了很多生物体的多肽,而且几乎所有生物过程都受到多肽的调节,如神经传导、细胞增殖和生长等。因此,在胶原蛋白的研究中,胶原蛋白多肽的研究已经成为一个重要领域。在胶原蛋白的众多类型中,Ⅵ型胶原蛋白(CⅥ)几乎分布在所有结缔组织中,而且它还具有维持组织完整性,能促进增殖和抗凋亡、促进细胞迁移、刺激DNA合成,具有生长因子的特性[2,3]。 　　目前,研究证明Ⅵ型胶原蛋白亚单位的基因突变是导致Bethlem肌病的主要原因,而且Ⅵ型胶原蛋白大量沉积能