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烟草WRKY―R1基因的克隆及瞬时表达分析 　　摘要：以烟草根尖组织cDNA为模板，RT-PCR结合电子克隆得到NtWRKY-R1基因的完整ORF，序列分析显示，NtWRKY-R1具有WRKY转录因子家族典型的WRKYGQK保守结构域及C2H2的锌指结构，属于WRKY转录因子家族第Ⅱ类。采用生物信息学方法对NtWRKY-R1蛋白的理化性质、进化关系和磷酸化位点进行预测和分析，结果表明，NtWRKY-R1与茄科植物保守结构域的同源性及系统进化关系最近；磷酸化位点分析显示该蛋白可能通过磷酸化作用修饰，进而对其相应的代谢活动进行调节。通过构建真核表达载体、建立瞬时表达分析体系，结果显示，NtWRKY-R1基因的过表达导致JA信号途径标记基因PDF1.2及烟碱合成关键酶基因PMT1表达量降低，推测NtWRKY-R1基因影响JA信号途径，进而调控烟碱合成。 　　关键词：烟草； NtWRKY-R1；基因克隆；生物信息学分析；瞬时表达分析；信号途径 　　中图分类号：S572.035.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0012-06 　　WRKY是植物中最大的转录因子家族之一，因含有7个氨基酸组成的高度保守的WRKYGQK序列而得名。研究发现WRKY类转录因子广泛参与植物生物[1～3]、非生物[4，5]胁迫应答，植物衰老[1]和器官发育[6]等一系列生理活动。目前，有关WRKY转录因子的研究已取得很大进展，但主要集中在基因克隆、表达及通过功能缺陷或超表达研究其功能，对其介导的植物应答反应过程、逆境胁迫下的反应调控机制等仍然不清楚。 　　烟株打顶是一项重要的农艺措施，打顶后，烟草叶中的烟碱合成量增加。有研究表明，打顶可诱发烟碱生物合成增加是烟株响应伤害信号和激素水平改变等综合效应的结果。机械伤害诱导第二信使茉莉酸（JA）产生，JA信号途径诱导烟碱合成关键酶腐胺N-甲基转移酶（PMT）和鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因转录水平升高，促进烟碱的生物合成[12]。本课题组从烟草打顶前、后根尖组织消减抑制杂交（SSH）cDNA文库中筛选出一条wrky-like的EST（HO059652）序列[7]，采用电子克隆结合RT-PCR的方法克隆到该基因，并对其进行了生物信息学及瞬时表达分析，为探讨烟株打顶后烟碱合成能力增加的调控机制及该转录因子在地上部伤害刺激诱导根系次生代谢产物积累的分子机制奠定了基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　1.1.1植物材料供试烟草品种K326（Nicotiana tabacum L.cv. K326）。 　　1.1.2菌株、载体与主要试剂大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和植物表达载体pROK2由本实验室保存；TRIzol、MLV、pMDTM19-T Vector、纤维素酶等购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。引物合成和测序由上海生工生物工程有限公司完成。 　　1.2试验方法 　　1.2.1总RNA的提取及反转录选取生长5～6周的实验室栽培烟草K326植株，TRIzol法提取烟草根尖组织总RNA，反转录为cDNA，提取和反转录方法均参照试剂说明书。 　　1.2.2NtWRKY-R1基因的电子克隆以本实验室构建的烟草打顶前、后的SSH cDNA文库中筛选出的一条WRKY类转录因子EST序列（HO059652）为查询探针，在烟草的EST数据库中进行查询搜索，最后拼接得到一条含有完整ORF的cDNA序列。以此序列设计特异引物，以烟草根尖组织cDNA为模板，进行PCR扩增。引物序列F：5′-GCTAGGATCCCATGGATGGAAGATTCAAT-3′（划线处为BamHⅠ酶切位点）；R： 5′-TAGGTACCTCAGCCCGTGGTCCCACAC-3′（划线处为KpnⅠ酶切位点）。扩增产物连接至pMDTM 19-T Vector，转化大肠杆菌DH5α，鉴定并测序。 　　1.2.3NtWRKY-R1的生物信息学分析从NCBI数据库中BLAST得到拟南芥（AAS79556）、辣椒（AAZ99027）、马铃薯（ABU49724）、大豆（ABS18444）、蓖麻（XP_002522247）、棉花（ACD56629）、小麦（ABO15543）、水稻（DAA05131）的WRKY氨基酸序列。 　　依据MEGA 4.1软件对所获得氨基酸序列的保守结构域与NtWRKY-R1的保守结构域进行同源性比对和聚类分析；NtWRKY-R1蛋白的理化性质、磷酸化修饰和亲水性/疏水性分析分别用ProtParam、NetPhos 2.0 Server和ProtScale分析，蛋白二级结构的预测用Scansite、SOPMA在线工具完成。