SSR鉴定水稻两系杂交种纯度的运用与探讨 Ⅵ.不同引物判定同一样品植株纯度的准确性.docVIP

SSR鉴定水稻两系杂交种纯度的运用与探讨 Ⅵ.不同引物判定同一样品植株纯度的准确性 　　摘要：将同一样品在室内用不同引物对各植株进行检测，并与田间检测结果比对，发现不同方法对杂株的判别能力不同，并分析了导致同一植株出现不同判定结果的原因，为降低分子检测和田间鉴定结果之间的误差提出了相应技术对策。 　　关键词：两系杂交稻；SSR；不同引物；同一样品植株；纯度鉴定；准确性 　　中图分类号：Q789；S511 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）01-0019-03 　　利用SSR分子标记鉴定两系杂交稻种子纯度具有快速、稳定、重复性好、多态性高的优点，是现在室内鉴定种子纯度应用最为广泛的分子标记方法。该方法一般是从大量的引物中筛选出多态性高、共显性强、双亲谱带清晰的1对引物来鉴定杂交稻种子的纯度[1-5]。在实验操作中，筛选出的引物往往不止一种[6，7]，这些引物对同一品种都具有多态性，且都符合引物筛选的标准。就意味着多对引物都可用于同一品种的纯度鉴定，这为引物筛选和品种鉴定提供了方便。但就完全相同的一份样品而言，不同引物对杂株类型及杂株数量的识别能力是否一致很少见诸报道[8-12]。本研究的目的在于探讨同一样品的各植株分别用3～4对不同的引物检测，并与田间检出的杂株比对，比较不同引物对杂株识别能力的差异，分析误差产生的原因并提出相应对策。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　试验所用杂交稻苯两优639、天两优616、两优17及其亲本均由湖北省种子管理局提供。2010年已做过田间正季鉴定，分别代表全省当年种子纯度高、中、低3个类型的样本群体。所用引物及试剂均由北京鼎国生物有限公司提供。 　　1.2 PCR反应体系 　　PCR扩增反应总体积10 μL：10×Buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，50 ng/μL引物0.2 μL+0.2 μL，2 U/μL Taq DNA聚合酶 0.6 μL，25 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃下延伸7 min。扩增产物在浓度为3%、含EB的琼脂糖凝胶中进行电泳后，应用凝胶成像系统观察记录。 　　1.3 DNA模板制备和引物筛选 　　DNA模板的制备采用农业部推荐的简易法分别提取各单株的DNA。引物的筛选见文献[13]，即从农业部推荐的用于纯度鉴定的44对SSR多态性引物中筛选出适合于上述品种的3～4对最佳引物进行分子鉴定（表1）。 　　1.4 田间种植情况及纯度鉴定 　　3个试验品种都进行了田间正季鉴定，于2011年4月15日播种，5月15日移栽。每品种田间种植1个小区，每小区500株，共50行，每行10株，行距26.7 cm，株距16.7 cm。在抽穗前及齐穗后分两次按GB/T 3543.5―1995进行田间纯度鉴定，并观察比较各品种间的植物学形态特征和生物学特性。 　　1.5 纯度结果比对 　　秧苗移栽20 d后，在田间按植株编号逐株剪取其倒数第二叶，用表1中筛选的3～4对引物检测。将室内鉴定的杂株与田间杂株进行比对，根据比对结果，再将室内鉴定出的杂株和田间鉴定的所有杂株取样，回室内再次鉴定。通过反复比对室内和田间的杂株类型，判断SSR分子标记检测结果的准确性与一致性。 　　2 结果与分析 　　两优17有效鉴定株数495株，用4对引物进行室内鉴定并根据植物学形态特征和生物学特性进行田间鉴定，共检出88株杂株。其中，田间鉴定检出7种类型，共48株杂株；分子检测时RM212检出杂株52株，RM17和RM1各检出杂株55株， RM21检出杂株72株。苯两优639有效鉴定株数344株，田间鉴定出杂株7株，分子检测时RM263检出杂株4株，RM17和RM208各检出杂株6株。天两优616有效鉴定株数316株，田间鉴定出杂株17株，分子检测时RM263检出杂株7株，RM17检出杂株12株，M5检出杂株13株，RM243检出杂株14株。就同一植株而言，田间和室内判断结果存在差异，不同引物之间的判断结果也不尽相同，主要表现为以下几个方面。 　　2.1 不育系和恢复系的杂株均能被各引物准确检出 　　两优17田间鉴定出恢复系有3株，不育株有9株，在室内检测中，这些杂株都能够被4对引物检出，并表现为典型的两优17恢复系和不育系谱带；苯两优639田间鉴定出不育株有2株，在室内检测中，这些杂株都能够被3对引物检出，并表现为典型的苯两优639不育系谱带；天两优616田间鉴定出不育株有3株，在室内检测中，这些杂株都能够被4对引物检出，并表现为典型的天两优616不育系谱带。