侧孢芽孢杆菌的耐热性实验.docVIP

侧孢芽孢杆菌的耐热性实验 [摘 要]将湖北绿天地公司的侧孢样品分别用缓冲液、自来水和纯水稀释后，在80℃下处理，每五分钟取样检测其活菌数计算死亡率。结果显示湖北绿天地的侧孢芽孢杆菌产品是耐热的，在80℃水浴中处理60分钟，最高死亡率为50.4%。检测所用稀释介质影响死亡率，建议检测的稀释介质采用0.05M的磷酸缓释冲液（PH6.24）。 [关键词]侧孢芽孢杆菌；实验；耐热性 中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）42-0335-02 1. 实验仪器和试剂 1.1 实验仪器：电子天平，电热恒温水浴锅（±1℃），WH-2微型漩涡混合仪，恒温冷冻摇床，超净工作台，隔水式电热恒温培养箱，高压灭菌锅。 1.2 实验器材：500ml三角瓶，250ml三角瓶，18*180试管，1ml刻度移液管，10ml刻度移液管，试管硅胶塞，培养皿（￠90），玻璃珠，100ml量筒。 1.3 实验试剂：蛋白胨（BR），牛肉膏（BR），葡萄糖（AR），琼脂条，40%NaOH，精密试纸PH5.5-9.0，Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），纯水。 2.实验方法与步骤 2.1 实验试剂的配制与用具准备 2.1.1 检测培养基配方：蛋白胨10克，牛肉膏5克，葡萄糖5克，琼脂条20克，1L纯水，PH7.0-7.2。 2.1.2 0.05MPBS溶液的配制：甲液：乙液1：4的比例配制（PH6.24左右） 甲液 0.05mol/L Na2HPO4 称取Na2HPO4 9.465g加水至1000ml。 乙液 0.05mol/L KH2PO4 称取KH2PO4 9.27Gg加水至1000ml。分装于棕色瓶放置于4℃冰箱。 2.1.3 分装包扎检测培养基 ，分别包扎培养皿，试管，刻度移液管及测样PBS，纯水及自来水（PH6.0左右），500ml玻璃珠三角瓶等。 2.1.4 将所有用具，培养基，检测用稀释介质等在高压灭菌锅内121℃保压30min，灭菌备用。 2.2 实验步骤 2.2.1 样品的预处理 分别称取待测样5-10g（精确0.0001g）3份于三个500ml带玻璃珠摇瓶内分别标记A、B、C。A中加90-95mlPBS，B中加90-95ml自来水，C中加90-95ml纯水。将三个玻璃珠瓶放置在恒温冷冻摇床上130r/min低于25℃条件下摇均匀待用。检测培养基完全溶化后放置在55℃水浴锅内保温待用。 2.2.2 分别测A，B，C的活菌数（以A为例，B、C测定方法相同） 2.2.3 样品稀释液的准备向20支无菌试管分别加入9mlPBS，试管上标记样品号和稀释倍数的字样，操作需在超净工作台上进行。 2.2.4 样品的稀释 吸取1.0ml试样悬液于第1支试管中，再从第1支试管中吸取1.0ml试样悬液于第2支试管中，依次进行10倍稀释到第6支试管（第6支试管需做两次重复），再从两个第6 支试管中分13次每次吸取1.0ml分别加到剩余13支试管中。（每次试样溶液稀释时，加样后的试管需在微型漩涡混合仪上震荡至少30-60s，再进行下一次操作。） 2.2.5 从已混合好的最后13支试管中取12支试管放入80℃水浴锅中水浴，在温度平衡后每5min取出一支试管冷却（至到第60min为止）。然后每只试管分别重新再在旋涡混合仪上混合均匀。第13支试管加样品悬液后不做热处理。用1ml无菌移液管从这13支试管中的每支试管中分别精确吸取1.0ml试样溶液加到一套无菌培养皿中，每支试管做4个培养皿，即4次重复。 2.2.6 取溶化好并保温在水浴锅中的培养基倒入每个培养皿10-15ml，并迅速将菌悬液与培养基混合均匀。平板在净化工作台上静置30分钟，待培养基凝固好后，置入37℃恒温培养箱内倒置培养48-72h。 2.3 计数 2.3.1 培养2-3天后取出计平板上的菌落数。 2.3.2 小于30或大于300个菌落的平板不作计数，为无效平板，需重做检测。 2.4 计算 2.4.1 试样中侧孢芽孢杆菌的芽孢数N K*10n/M 2.4.2 死亡率（Q）的计算 3. 实验结果及讨论 3.1 实验结果 PBS、自来水、纯水分别稀释，80℃水浴每五分钟取样检测数据（两次以上检测数据）如下表： 纵轴为死亡率，横轴为水浴时间制备曲线图如下： 3.2 讨论 3.2.1 从图1明显看出用PBS作为稀释介质检测的死亡率比自来水和纯水处理的死亡率要低很多。 3.2.2 PBS稀释水浴后检测出现负值说明侧孢芽孢杆菌能耐热，且在那个水浴时间的分散效果比较理想。 3.2.3 PBS 最高死亡率出现在25min，死亡率为14.5%；自来水最高死亡率出现在20min， 死亡率为47.4%；纯水最高死亡率出现在25min，死亡率为50.4%。 3.2.4 PBS最低死亡率在35m