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动物选择 动物的种系非常重要,必须选择同一个种系的小鼠,即使是同一个种系不一个卖家的老鼠,也能够表现出对MPTP不同的敏感性，也会对实验结果产生影响.最多见的是：雄性，至少8周龄，体重至少22g，从同一个实验动物中心获得。 在MPTP导致的动物模型中最常见的一个问题是动物的急性死亡，发生在在MPTP第一次注射后的24h内。这种急性死亡和多巴胺能系统的损伤无关，而是由于外周心脑血管的副作用，这种反应是剂量依赖性的并且在某些种系和雌性老鼠中更为明显。 注射时间安排： 急性中毒－一天注射一针或者几针． 亚急性或者慢性中毒－连续或者非连续的注射几天甚至一周，但是由于ＭＰＴＰ代谢很快，所谓的亚急性或者慢性中毒实际上是连续的损伤． 最常用的方法：１，每两小时注射一次，每天注射八小时，共四次．依据剂量不同，纹状体区多巴胺损伤在４０％（１４ｍｇ／ｋｇ＊４次）－９０％（２０ｍｇ／ｋｇ＊４次），多巴胺能神经元在邢台上呈现非凋亡性质的死亡，纹状体多巴胺神经元至少死亡４０－５０％，多巴胺能神经元的损伤可以在注射完成之后持续７天． 　２．每天注射一次．３０ｍｇ／ｋｇ，连续注射５天．可以导致４０－５０％的损伤，可以在注射完毕后持续２１天． ＭＰＰ+的含量在大概９０ｍｉｎ后达到高峰，在最后一针注射后８ｈ后小时．这样，就可以设计时间点，类似５０，７０，１１０，１３０ｍｉｎ和６，７，９，１０ｈ． 设计神经退行性变的时间点：每个时间点５－６个老鼠，分别在最后一针注射完毕后第２，４，,７，１４，２１，３０ｄ，然后收集组织块儿，处理分析多巴胺能系统． 最好订购小的ＭＰＴＰ，例如１０或者１００ｍｇ的，而不是大瓶的，这样就可以直接加盐水溶解，而不需要称量。 MPTP作用机理: MPTP为一种脂溶性的物质,分子量小,易透过血脑屏障,被星形胶质细胞,5-羟色胺神经元等细胞摄取后,在单胺氧化酶B MAO-B 的作用下活化,转变为中间代谢产物MPFP+,生成有毒性的MPP+,释放到细胞外间隙,被多巴胺能神经元轴突末梢通过突触前膜多巴胺转运体摄取,逆向运输到黑质多巴胺神经元胞体,阻止线粒体呼吸链,导致能量衰竭,随后增加ROS.NO等自由基的释放,反应性胶质细胞增生等引起黑质多巴胺能神经细胞的死亡与凋亡. 造模方法: 选用对MPTP最敏感的C57BL/6J,小鼠,年龄在8-16周,体重在22-25g,雄性,腹腔注射MPTP·HCl Sigma . 一个比较常用的方法是每2h注射一次,每天注射八小时,一共四次. 根据药物剂量的不同,纹状体区的多巴胺能损伤到40% 14 mg/kg per dose×4 -90% 20 mg/kg per dose×4 .这种给药方法形成的损伤在注射完成之后可以持续7天.另一种比较公认的方法是每天注射一次,30mg/kg,连续注射5天,这种注射方法可以引起纹状体多巴胺神经元的坏死,达到40%-50%的减少,多巴胺能神经元的损伤可以在MPTP注射完成之后持续21天. 在给药期间出现的一个最严重的问题是小鼠在接受第一次药物注射后的24h内会出现急性死亡,死亡率大于20﹪.这种死亡并非由于多巴胺能系统的损伤而引起,而是由于外周心血管的副作用,这种急性死亡是剂量依赖性的,在某些种属和雌性小鼠表现尤为突出 在MPTP注射以后,MPP+含量将会在90min左右达到高峰,并且在最后一针注射完成8h后不再检测到有MPP+.注射完成后可以选择每5-6只老鼠为一个时间点,分别在第 4, 7, 14, 21和第30天检测多巴胺能神经元变性的情况. 取材: ①麻醉小鼠 戊巴比妥 35-45mg/kg ②经颈动脉灌流,起初以10ml/min的速度灌流生理盐水3分钟,然后用4﹪的多聚甲醛灌注8min. ③轻轻的将脑组织取下,在多聚甲醛溶液中过夜后固定,溶液量至少要大于脑组织体积的十倍. ④将脑块儿置于30﹪的蔗糖溶液中 0.1M PBS,PH 7.1-7.4 ,浸泡至少48h,使得脑块沉入容器底部. ⑤冰冻切片机切脑片30-40um,进行免疫组化染色. 高尔基染色: ①将动物麻醉. ②将已麻醉的动物固定在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子假期腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向外侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧分开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤前进,将止血钳翻向外侧,充分暴漏心脏.小心用镊子将心包打开. ③将灌注针插入左心室,同时剪开右心耳,打开调节阀,灌注生理盐水,待血液流净时改为灌注固定液多聚甲醛，直至全身组织器官变硬为止。 ④将小鼠头剪下，分离皮肤和颅骨，小心将脑取出，置于多聚甲醛固定液中浸泡过夜。 ⑤第二日，将脑块浸入高尔基染色液中，置于黑暗处浸泡14天，并每三天更换一下瓶中液体。 ⑥第