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有光学活性藻蓝蛋白的异源重组表达条件优化 　　[摘 要]为了优化重组表达藻蓝蛋白的表达水平和光学活性，本文将Arthrospira platensis FACHB314中合成有光学活性的藻蓝蛋白相关基因ussBcpcBA，hox1，pcyA，cpcE，cpcF共转化大肠杆菌，进行了藻蓝蛋白的异源重组表达，通过三因素三水平的正交实验得出菌体的最佳诱导表达条件为37℃，0.1mmol/L的IPTG诱导表达2小时。研究了不同处理条件对重组表达菌体低温荧光的影响，优化了处理菌体沉淀的溶液为pH 7.0，0.01mol/L的PBS溶液。本研究为有光学活性藻蓝蛋白的异源表达、检测和应用奠定了基础。 　　[关键词]荧光活性；藻蓝蛋白；重组表达，诱导 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）11-0351-04 　　Optimization of the inducementand treatment conditions forthe recombinant expression of opticalPhycocyaninin Escherichia coli 　　FENG Xiaoting， Wu Fei， Huang Xiaoyun， JIN Yuming， XIAO Dongfang， ZANG Xiaonan*， ZHANG Xuecheng 　　引言 　　节旋藻（Arthrospira）是一种丝状蓝藻，藻蓝蛋白是其吸收和传递光能的色素蛋白，它不仅具有抗氧化，抗肿瘤等作用[1-4]，还是一种天然色素，可以作为食品添加剂广泛用于医药、食品、化妆等行业[5]，具有很高的应用价值。 　　利用异源系统合成有光学活性的藻蓝蛋白，不仅可以获得大量的藻蓝蛋白，而且便于对其进行修饰和改造，以及用于光合系统重建，满足人们多方面的需求。Tooley[6]等首次实现了在大肠杆菌中合成荧光活性藻蓝蛋白。关翔宇等[7]用一个表达载体完成荧光活性藻蓝蛋白的体外合成。本实验室衣俊杰等[8]进行了光学活性藻蓝蛋白组合生物合成，发现含有藻蓝蛋白亚基基因ussBcpcBA，色基裂合酶基因cpcE，cpcF，以及催化合成藻蓝胆素的hox1，pcyA基因组合表达时荧光效果最好。随着研究的不断深入，重组表达藻蓝蛋白的光学特性以及催化合成有光学活性藻蓝蛋白的元件的功能等成为人们研究的重点。此外人们对于有光学活性藻蓝蛋白的需求日益增加，迫切要求优化藻蓝蛋白的重组表达条件和检测方法。 　　外源蛋白在大肠杆菌中诱导表达受到许多条件的影响，如宿主菌的选择，密码子的偏爱性，温度，时间，诱导剂IPTG的浓度等因素[9]。本实验中表达有光学活性的藻蓝蛋白，涉及到5个基因――ussBcpcBA，hox1，pcyA，cpcE，cpcF，分别构建在两个相容质粒pET24a和pACYC- Duet中，其中hox1、pcyA基因翻译合成的亚铁血红素氧化酶和铁氧蛋白氧化还原酶催化合成藻蓝胆素，构建在表达载体pET24a中；ussBcpcBA是藻蓝蛋白β亚基和α亚基基因，cpcE和cpcF翻译表达色基裂合酶，可催化藻蓝蛋白与藻蓝胆素结合，ussBcpcBA和cpcE-cpcF分别构建在表达载体pACYC- Duet的两个表达框中。为保证各基因之间协调表达，获得最优的光学活性，本研究在前期实验基础上，选取温度，时间，诱导剂IPTG的浓度进行了三因子三水平的正交实验设计，通过检测单位质量藻蓝蛋白的低温荧光发射光谱以确定最优的诱导表达条件。另外，由于蛋白的稳定性受处理溶液的影响[10-11]，本实验进一步检测了不同溶液，不同pH和浓度的PBS重悬表达有荧光活性藻蓝蛋白的菌体沉淀对低温荧光发射光谱的影响，以便得到稳定的荧光检测结果。本研究为重组表达和检测有光学活性藻蓝蛋白提供实验基础。 　　1 材料 　　表达菌株E.coli/uBAEF（314）由本实验室构建，含有表达载体pET-24a（+）-hox1-pcyA及pACYC-ussBcpcBA-cpcE/F。 　　2 方法 　　2.1 重组菌诱导表达条件的研究 　　单因子预实验发现温度在20-37℃，IPTG浓度在0.1-10mmol/L，诱导时间在2-10h都能使重组菌表达有光学活性的藻蓝蛋白，因此，设计了三因素三水平的正交实验确定最优的诱导表达条件，如表1。 　　2.2 重组表达菌的低温荧光检测 　　对菌体进行低温（液氮温度）荧光光谱检测，扫描速度1200nm/min，狭缝宽度5.0nm，电压为950V，用590nm激发波长对处理样品进行荧光激发。 　　2.3 重组表达菌的SDS及western blot检测 　　重组菌进行藻蓝蛋白的SDS，配制的浓缩胶为5%，分离胶为12