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泛影葡胺灌肠剂微生物限度检查方法验证 　　摘要：目的：对5%泛影葡胺灌肠剂微生物限度检查方法进行方法学验证。 　　方法：采用平皿记数法，分组分别使用5种实验菌验证。试验组取供试液加菌液注入培养基中培养。菌液组分别取各实验菌液注入培养基中培养。稀释剂对照组取稀释剂加菌液注入培养基中培养。供试品对照组取供试液注入培养基中培养。通过3次独立的平行试验，分别计算各试验菌每次试验的回收率。采用观察大肠埃希菌与阴性金黄色葡萄球菌在相同环境下的培养来验证控制菌的检查方法。 　　结果：各试验菌的回收率均高于70%，稀释剂对5种试验菌的回收率均高于70%。 　　结论：采用常规法可以进行本品的微生物限度检查。 　　关键词：5%泛影葡胺灌肠剂 方法学验证 　　【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）10-0577-02 　　5%泛影葡胺灌肠剂是广东裕龙医学影像科技有限公司的结直肠CT三维重建软件（商品名：CT虚拟结直肠镜系统）专属配套使用的一种灌肠造影剂。它是由泛影酸与葡甲胺的水溶液。根据《中国药典》（2010年版）的要求[1]，不同的药品微生物限度中的细菌数、霉菌数及酵母菌数测定，必须按照经过验证的方法进行，以保证测定方法的可靠性。本研究对我公司5%泛影葡胺灌肠剂的微生物限度检查进行了方法验证，为规范制剂的微生物限度检查提供依据。 　　1 材料与仪器 　　1.1 样品：5%泛影葡胺灌肠剂，批号20130802生产厂家：广东裕龙医学影像科技有限公司。 　　1.2 培养基：胆盐乳糖增菌液，批号：110610；虎红琼脂，批号：1102212；营养琼脂，批号：110323；营养肉汤，批号：130417。以上培养基购自北京三药科技开发公司和上海中科昆虫生物技术开发有限公司。 　　1.3 菌种：枯草芽孢杆菌。GIM1.136，批号金黄色葡萄球菌GIM1.178，批号大肠埃希菌GIM1.176，批号铜绿假单胞菌GIM1.200，批号白色念珠菌GIM2.169，批号黑曲霉菌GIM3.412，批号以上菌种购自广东省微生物菌种保藏中心。 　　1.4 培养箱HWS-250。型恒温恒湿培养箱；HRNJⅡ霉菌培养箱。 　　2 方法与结果 　　2.1 菌液制备[2]。取经37℃培养18～24h金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌营养肉汤培养物标准比浊管比浊后10倍稀释成50～100cfu/ml，备用。取经25℃培养18～24h的白色念珠菌真菌液体培养物标准比浊管比浊后10倍稀释成50～100cfu/ml，备用。取经25℃培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3ml盐水洗下霉菌孢子，取菌液，用标准比浊管比浊，10倍稀释成50～100cfu/ml，备用。 　　2.2 供试品制备。称取样品10ml，加pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液100ml制成1∶10的供试液。 　　2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法。验证供试液分别污染上述5种代表试验菌株，再加15～20ml规定的琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72h，观察结果，平板计数，测定回收率。平皿法：采用供试液1ml/皿，培养基稀释法：0.2ml/皿。 　　2.4 回收率测定。试验组：取1∶10供试液1ml置平皿中，同时加入50～100cfu/ml试验菌株于平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72h观察结果。菌液组：测定所加的试验菌数。供试液对照组：测定供试品本底菌数。稀释剂对照组：方法同试验组。控制菌检查阴性菌对照：大肠埃希菌。 　　2.5 结果。判断：《中国药典》（2010年版）规定在独立平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率不低于70%；试验组的菌回收率均不低于70%，则可按该药品供试液制备方法和计数方法进行细菌、霉菌及酵母菌数的测定；控制菌检查阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组检出试验菌，则可按该药品供试液制备方法和控制菌检查方法检查。 　　2.5.1 试验菌回收率测定结果。试验组采用平皿法测定污染菌的回收率，显示为金黄色葡萄菌100%，枯草芽孢杆菌40%，白色念珠菌91%，黑曲霉菌93%，大肠埃希菌96%，该样品对5株代表菌经验证对大肠埃希菌、金葡菌、白色念珠菌、黑曲霉菌无明显的抑菌作用，回收率均在70%以上，但对枯草芽孢杆菌有抑菌作用，回收率在70%以下。但在本实验中样品经采用培养基稀释法（0.2ml/皿）测定时，样品对枯草芽孢杆菌无明显抑菌作用，回收率为79%。 　　2.5.2 控制菌检查方法。对2组同时进行试验，试验组：取供试液10ml