质粒DNA的提取碱变性提取法.docVIP

 质粒DNA的提取—碱变性提取法 实验目的： 掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 仪器和材料； 恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器；1.5ml离心管，50ml离心管；不同型号的的枪尖等。 菌体：E.coliDH5α 受菌体，具有AMPr标记的质粒PUC19。 实验试剂： LB培养基，抗生素，溶液I，溶液II，溶液III，试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、