铁皮石斛HSP70基因的克隆及冷胁迫表达分析.docVIP

铁皮石斛HSP70基因的克隆及冷胁迫表达分析 　　[摘要] 目的：揭示铁皮石斛热激蛋白HSP70基因冷胁迫表达，为耐低温品系选育提供分子生物学基础。方法：根据已获得的HSP70基因片段序列，采用RACE方法从铁皮石斛中克隆到HSP70基因全长cDNA序列。预测其编码蛋白的结构与功能，并运用实时定量PCR进行冷胁迫下表达分析。结果：核苷酸序列分析表明该基因全长2 296 bp，包含一完整的1 944 bp的开放阅读框，编码647个氨基酸。氨基酸序列具有典型的HSP70特征并且与其他植物的HSP70有很高的同源性。冷胁迫表达分析说明该基因确实能被低温诱导表达。结论：首次克隆获得受低温诱导表达的铁皮石斛HSP70基因，为进一步研究铁皮石斛健康栽培与抗寒品系的选育奠定基础。 　　[关键词] 铁皮石斛；HSP70基因；生物信息学分析；冷胁迫表达分析 　　铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是传统名贵珍稀中药材，现代药理研究表明具有益胃生津、滋阴清热等独特功效[1]。因过度采挖、栽培环境破坏野生铁皮石斛资源基本枯竭。20世纪90年代以来，随着铁皮石斛组织培养、设施栽培等一系列关键技术的突破，铁皮石斛产业取得了跨越式发展[2]。进入21世纪以来，浙江省铁皮石斛产业技术战略联盟等技术创新团队，在铁皮石斛原生态栽培上又取得了突破性进展，而铁皮石斛抗寒能力是制约原生态栽培的主要瓶颈[3-4]。 　　热激蛋白（HSP）是生物体受到不良环境因素影响时诱导合成新合成或者是增加合成的一类应激蛋白，是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分，以保护细胞免受进一步的损伤，对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用[5]。热激蛋白按相对分子质量大小可分为HSP110，HSP90，HSP70，HSP60，小分子sHSP和泛素等6个家族[6]，其中HSP70是HSP家族中最保守、最主要、分布最丰富的一类[7]。目前大量研究表明HSP70在胁迫消除后不会马上降解，在一段时间内保持一定的含量，对生物较长期适应环境起重要作用[8]，而HSP70不但在热刺激条件下表达，在冷胁迫下也有相应的表达[9-11]。但有关铁皮石斛HSP70基因对抗寒机制的研究尚无报道，作者利用实验室在冷胁迫下铁皮石斛抗寒相关基因差异显示中获得的HSP70基因序列进行了HSP70全长克隆[12]，在对其进行序列特征和进化分析的基础上，通过转录水平的表达分析，研究该基因在冷胁迫处理下的响应特征，旨在探讨冷胁迫下铁皮石斛HSP70的应答机制及耐受机制，对铁皮石斛的健康栽培和耐低温品系选育具有一定意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 植物材料及主要试剂 　　供试材料铁皮石斛来源于浙江农林大学遗传学科铁皮石斛组培室（生长期 240 d，光周期 16 h·d1，温度 25 ℃），经浙江农林大学天然药物研发中心斯金平教授鉴定为铁皮石斛D. officinale。所取材料立即放入低温冰箱中4 ℃低温胁迫，分别于0，1，2，4，8，12，24，48 h取幼嫩叶片并液氮中速冻，然后于-70 ℃下保存备用。 　　RNAiso Plus（Code No.9108）试剂盒、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Code No.6110A）试剂盒、Premix Ex Taq （Code No.RR390A）酶和荧光定量试剂盒SYBRPremix Ex TaqTM （Code No.DRR091S）等购自Takara公司；克隆载体pGEM-T Easy Vector购自Promega公司；克隆所用大肠杆菌Escherichia coli DH5α为本实验室保存；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自XYGEN生物技术（杭州）有限公司；SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 铁皮石斛RNA的提取及反转录 采用改良CTAB法提取铁皮石斛总RNA，取0.2 g 铁皮石斛幼嫩叶片，置于液氮中研磨至粉末，迅速转移至提前65 ℃预热含1 mL CTAB和20 μL β-巯基乙醇的2 mL离心管中，剧烈震荡混匀。65 ℃继续水浴20 min，期间不断颠倒混匀，防止样品凝固于管底。水浴后冷却至室温，然后加入800 μL氯仿-异戊醇（24∶1）振荡均匀，于4 ℃下12 000 r·min1离心10 min。小心吸取上清液至一新的2 mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1）震荡混匀，重复上一步骤，直至中间层无白色絮状沉淀为止。转移上清液至1.5 mL离心管，加入1/3体积的LiCl，混合均匀，于4 ℃冰箱中沉