柱前衍生化RP—HPLC测定鸡内金中16种氨基酸的含量.docVIP

柱前衍生化RP—HPLC测定鸡内金中16种氨基酸的含量 　　[摘要] 采用酸水解法制备水解氨基酸样品溶液，以异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生化后进行HPLC分析。采用Ultimate Prime C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A 0.1 mol·L-1醋酸钠溶液（调pH至6.5）-乙腈（93∶7），流动相B乙腈-水（8∶2）；流速1.0 mL·min-1；柱温40 ℃；检测波长254 nm；梯度洗脱。氨基酸衍生溶液在36 h内保持稳定，16种氨基酸线性相关系数均大于0.999 5，加样回收率在98.01%～101.8%。该方法操作简便，精密度和重复性良好，可用于鸡内金中16种水解氨基酸含量的测定。 　　[关键词] 鸡内金；氨基酸；衍生化；异硫氰酸苯酯；高效液相色谱 　　[收稿日期] 2013-10-10 　　[基金项目] 国家药品标准科研项目；上海市自然科学基金项目（13ZR1442000） 　　[通信作者] 修彦凤，副教授，E-mail：xiuyf@ 　　[作者简介] 梁琨，讲师， E-mail：dolphin000000@163.com 　　鸡内金为雉科动物家鸡 Gallus gallus domesticus Brisson的干燥沙囊内壁。杀鸡后取出鸡肫，立即剥下内壁，洗净，干燥。鸡内金性味甘，平，归脾、胃、小肠、膀胱经。具有健胃消食、涩精止遗、通淋化石的功效，用于食积不消、呕吐泻痢、小儿疳积遗尿、遗精、石淋涩痛、胆胀胁痛。近年来，随着鸡内金在临床上的应用越来越广泛，对鸡内金的质量提出了更高的要求，而《中国药典》2010年版仅以醇溶性浸出物和灰分为指标，没有指标成分的含量测定。 　　现代研究表明，鸡内金主要含有蛋白质、多种氨基酸、维生素和微量元素等。氨基酸作为蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质，是人体的必需营养成分之一。笔者利用PITC柱前衍生化方法针对鸡内金中16种氨基酸类成分进行了测定。 　　1 材料 　　Agilent HPLC1100系统：四元泵、真空在线脱气机、二极管阵列检测器（DAD）、Agilent ChemStation 工作站；BT25S电子天平（1/10万，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；FE20 pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。 　　16种氨基酸对照品，批号分别为L-天冬氨酸（Asp）110103，L-谷氨酸（Glu）110109，L-丝氨酸（Ser）120116，L-甘氨酸（Gly）120301，L-组氨酸（His）120112，L-精氨酸（Arg）101201，L-苏氨酸（Thr）120113，L-丙氨酸（Ala）120117，L-脯氨酸（Pro）100311，L-酪氨酸（Tyr）120201，L-缬氨酸（Val）120113，L-蛋氨酸（Met）110125，L-异亮氨酸（Ile）110801，L-亮氨酸（Leu）120117，L-苯丙氨酸（Phe）090712，L-赖氨酸（Lys）100423，以上对照品均购自上海友思生物技术有限公司，纯度均≥98%；10批鸡内金分别购买于安徽（1）、湖南（2）、浙江（3）、上海（4）、内蒙古（5）、广东（6）、江苏（7）、云南（8）、河北（9）、山东（10），由上海中医药大学修彦凤副教授鉴定为雉科动物家鸡G. gallus domesticus的干燥沙囊内壁。 　　异硫氰酸苯酯（PITC）纯度标示量为97.0%（Alpha Aesar 公司）；乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；醋酸钠、三乙胺、盐酸、正己烷、冰醋酸均为分析纯，购于国药集团上海公司；纯净水为Milli-Q纯水。 　　2 方法与结果 　　2.1 色谱条件及系统适用性试验 　　Ultimate Prime C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A 0.1 mol·L-1醋酸钠溶液（以冰醋酸调pH为6.5）-乙腈（93∶7），流动相B乙腈-水（8∶2），梯度洗脱程序见表1；流速1.0 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量5 μL；检测波长254 nm。 　　2.2 溶液的制备及衍生化 　　2.2.1 混合对照品储备溶液的制备 精密称取16种氨基酸对照品于量瓶中，用0.1 mol·L-1盐酸溶液定容，配制成每1 mL分别含L-天冬氨酸（Asp）0.329 2 mg，L-谷氨酸（Glu）0.332 8 mg，L-丝氨酸（Ser）0.262 0 mg，L-甘氨酸（Gly）0.283 6 mg，L-组氨酸（His）0.392 8 mg，L-精氨酸（Arg）0.438 0 mg，L-苏氨酸（Thr）0.291 6 mg，L-丙氨酸（Ala）0.224 4 mg，L-脯氨酸（Pro）0.293 2 m