荧光定量PCR技术原理与应用详解.pptVIP

Trouble shooting 常见问题 可能原因 解决方法 Housekeeping gene无信号 RNA降解 用新鲜组织提取RNA Housekeeping gene 有信号 而目标基因无信号 1. 目的基因表达低。 逆转录效率不高 2. PCR引物不良 1. 富集mRNA 2. 在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。 3. 尝试不同PCR引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。 4. 尝试不同热循程序，降低复性温度。 Housekeeping gene 反应效率正常,但目标基因放大效率不高 PCR引物不良 重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段， 考虑不同剪接体 目标基因表达丰度在样本之间异常一致 RNA被基因组DNA污染 使用跨intron 引物 用DNase处理RNA 确保RNA阴性对照表现阴性 溶解曲线出现杂峰 出现非特异PCR产物 出现引物二聚体 尝试不同PCR引物 尝试不同热循程序，升高复性温度 修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与PCR特异产物解链温度之间。 阴性对照在30个循环以内出现信号 试剂被污染 注意区分信号是来自引物二聚体还是PCR产物 查找，替换污染试剂 2. 使用UNG系统。 挣脱枷锁 破茧成蝶 我终于毕业了 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫