定点突变操作步骤.docVIP

Muta-direct?定点突变试剂盒 操作方法 [A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct?酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。 设计点突变引物。 [注]参考引物设计指导 准备模板质粒DNA [注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。 [选项]对照反应体系（50μl反应体系） 10×Reaction Buffer 5μl pUC18 control plasmid（10ng/μl, total 20ng） 2μl Control primer mix（20pmol/μl） 2μl dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl ddH2O 38μl Muta-direct? Enzyme 1μl 样品反应体系（50μl反应体系） 10×Reaction Buffer 5μl Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl Sample primer F （10pmol/μl） 1μl Sample primer R （10pmol/μl） 1μl dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl ddH2O 38μl Muta-direct? Enzyme 1μl PCR反应条件 [注]按如下参数设置PCR扩增条件。 Cycles Temperature Reaction Time 1cycle 95℃ 30sec 15cycle 95℃ 55℃ 72℃ 30sec 1min 1min per plasmid Kb PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。 [注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。 Mutation Cycles 1~2Nucleotide 15cycles 3Nucleotides 18cycles [B] 突变质粒选择 PCR反应结束后使用Mutazyme?酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。 准备PCR反应产物。 加入1μl（10U/μl）Mutazyme?酶37℃温育1小时。 [注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme?酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme?酶用量。 [C]转化 反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5α。 将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。 接下来可以参照一般的转化步骤进行。 序列分析 通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。 为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。 突变实例 以GGC→GAC为例 [突变反应体系] 10×Reaction Buffer 5μl Sample plasmid（6.3Kb，10ng/μl，total 20ng） 2μl Sample primer（F）（10pmol/μl） 1μl Sample primer（R）（10pmol/μl） 1μl dNTP mixture（2.5mM each） 2μl dH2O 38μl Muta-direct? Enzyme 1μl [PCR条件] Cycles Temperature Reaction Time 1cycle 95℃ 30sec 15cycle 95℃ 55℃ 72℃ 30sec 1min 1min per plasmid Kb [序列分析] 突变质粒测序结果 常见问题 解决方案 无单菌落出现 通过电泳检测PCR反应体系 如果是PCR反应的问题可以通过调节退火温度进行解决 检测感受态细胞的转化效率 突变率低 Mutazyme?酶处理不当 增加Mutazyme?酶用量或延长反应时间 检查模板质粒用量 质粒用量过多会引起突变率降低 错误突变 检测合成引物的质量