利用诱导性NR1条件基因敲除小鼠研究NMDA受体在空间记忆提取中的作用.docVIP

利用诱导性NR1条件基因敲除小鼠研究NMDA受体在空间记忆提取中的作用 【摘要】：大量研究表明，海马神经元突触的NMDA受体在空间记忆的信息处理过程中起着重要的分子开关的作用。长期空间记忆与其它类型的长期记忆一样，可分为获得、巩固、储存及提取四个阶段，探讨NMDA受体在空间记忆不同阶段的功能，不仅有助于理解空间记忆的形成过程和分子机制，还将对阐述记忆的本质等问题有重要启示作用。药理学和遗传学的证据都揭示海马NMDA受体的活性和NMDA受体依赖的突触可塑性在动物空间记忆的获得、巩固和储存阶段起着关键作用，在任务学习之前以及任务记忆的巩固和储存阶段阻断NMDA受体的作用、或敲除NMDA受体的核心亚基NR1基因，都将妨碍动物空间记忆的形成。但以往的工作对NMDA受体在记忆提取过程中的作用还少有涉及。本文将Cre／loxP重组系统与四环素操纵子中的人工转录活化因子tTA结合起来，即利用诱导性的条件基因敲除技术 第三代基因敲除技术 ，构建了在海马CA1亚区和前脑区特异性敲除NR1基因的小鼠，分别称iCA1-KO小鼠和iFB-KO小鼠。在这两种小鼠的染色体中，有4个基因位点同时被修饰。通过给小鼠喂食正常食物或含强力霉素 doxycycline，简称dox 的食物，可达到在时间上对NR1基因的敲除进行调控，即给小鼠喂食含dox的食物 6mg／g，下同 5天后，可获得基因敲除的效果；反之，小鼠体内的NMDA受体活性则不受影响。通过原位杂交和免疫染色的方法，证实喂食dox5天后，iCA1-KO小鼠中的NR1基因敲除限定在海马的CA1区，而iFB-KO小鼠中的NR1基因敲除则限定在前【关键词】：学习与记忆空间记忆记忆提取前脑海马CA1区NMDA受体NR1基因Cre/loxP重组系统Morris水迷宫诱导性条件基因敲除条件性味觉厌恶回避 CTA 【学位授予单位】：华东师范大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2006 【分类号】：Q789 【目录】：摘要5-8Abstract8-15第一章利用iCA1-KO小鼠研究NMDA受体在空间记忆提取过程中的作用15-59摘要15-17前言17-20第一节材料与方法20-36一.构建转基因小鼠20-281.构建转基因小鼠的一般方法20-222.Cre／+转基因小鼠的构建22-243.利用报告小鼠分析Cre转基因表达的型式24-264.tTA／+转基因小鼠的构建26-275.NR1-GFP／+转基因小鼠的构建27-28二.基因打靶小鼠——fNR1／fNR1小鼠的构建28-29三.获得可诱导、海马CA1亚区特异性NR1敲除小鼠 iCA1-KO小鼠 29-32四.iCA1-KO小鼠的检测32-361.试剂材料与仪器设备322.PCR检测基因型32-333.原位杂交检测NR1基因敲除部位33-344.免疫染色法检测NR1-GFP蛋白的表达345.水迷宫测试34-36第二节实验结果36-55一.PCR检测Cre／+、LacZ／+、tTA／+、NR1-GFP／+及fNR1／fNR1等小鼠的基因型结果36-37二.LacZ染色显示CA1-Cre／+转基因小鼠中Cre的表达仅在海马的CA1亚区37-38三.PCR检测iCA1-KO小鼠的基因型结果38-39四.原位杂交检测dox对NR1基因敲除的部位39-40五.免疫染色检测NR1-GFP蛋白的表达40-42六.利用水迷宫实验检测iCA1-KO小鼠的空间记忆能力42-55第三节分析与讨论55-59第二章利用iFB-KO小鼠研究NMDA受体在空间记忆提取过程中的作用59-88摘要59-61前言61-62第一节材料与方法62-67一.构建转基因小鼠及基因打靶小鼠62-63二.获得可诱导、前脑特异性NR1基因敲除小鼠 iFB-KO 63-65三.iFB-KO小鼠的检测65-671.PCR检测基因型652.原位杂交检测NR1基因敲除部位653.免疫染色法检测NR1-GFP蛋白表达654.行为学测试65-674.1水迷宫测试65-664.2条件性味道厌恶回避实验66-67第二节实验结果67-83一.LacZ染色显示FB-Cre／+转基因小鼠中Cre在前脑中特异性表达67-68二.PCR检测iFB-KO小鼠的基因型68-69三.原位杂交检测dox对NR1基因敲除的部位69-70四.免疫染色检测NR1-GFP蛋白在iFB-KO小鼠的表达70-71五.利用水迷宫任务研究前脑NR1基因在小鼠空间记忆提取过程中的作用71-81六.条件性味道厌恶实验测试NR1对味觉记忆的影响81-83第三节分析与讨论83-87研究小结87-88第三章学习与记忆神经机制的研究进展 综述 88-113第1节学习与记忆的定义和类别88-90第2节学习与记忆的解剖基础90-942.1陈述性记忆的神经环路90-93