级基因工程期末复习材料【参考】.docVIP

基因工程复习题 绪论 基因工程：按照人们的的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的心的生物类型，这就是基因工程。又称重组DNA技术或遗传工程 基因工程的操作步骤可简单概括为：分、切、接、转、筛、增 基因工程特点：在分子水平表达和细胞水平操作表达 构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节 基因工程工具酶指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需的酶，包括DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶。限制性核酸内切酶和连接酶是基因工程关键的工具酶。现在常用的DNA连接酶只有2种，即大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶 现代分子生物学领域理论上三大发现和三大发明对基因工程的诞生起决定作用： 三大发现：（1）DNA是遗传物质（2）揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理（3）遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定 三大发明：（1）限制性核酸内切酶的发现与DNA切割（2）DNA连接酶的发现与DNA片段的连接（3）DNA重组基因工程载体的研究与应用 实验中为什幺要筛选白斑，即原理是什么？ 有外源DNA片段插入到位于lacZ’的多克隆位点后，就会破坏α肽链的读码框，从而不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒的克隆往往是白色菌落 DNA重组试验中为什么用IPTG不用乳糖？ 因为培养基中的乳糖会被诱导合成的β—半乳糖苷酶所催化降解，从而使其浓度不断发生变化。常用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、硫甲基半乳糖苷(TMG) 第一章 核酸的制备 知识点： 生物体内的DNA绝大部分是B-DNA形式存在，（A、B、Z-DNA） 如何获得完整的DNA分子或大的DNA片段，是DNA制备中的一项关键技术。 每一种生物DNA的复制总是从特定位点起始，这个位点具有一点的核苷酸序列。将此核苷酸序列区称为复制起始位点 DNA的转录应包含转录启动子和转录区 -1 +1 +2 +1处为起录点。 在原核生物结构基因的起录点下游不远处，总有一个5—AGGAGG—3’的序列，转录出mRNA上的5’—AGGAGG—3’序列，与核糖30s亚基16srRNA3’端是5’—CCUCCU—3’互补成为30s亚基识别和结合mRNA的位点，把此序列称为SD序列。真核生物基因转录区部不有SD序列的互补序列 几乎所有真核生物的染色体DNA都是线形DNA,部分原核生物的染色体DNA也是以线形存在的。而大部分原核生物的染色体DNA和全部线粒体DNA、叶绿体DNA以及细菌的质粒DNA全是环状DNA分子。 环状DNA分子一般以超螺旋形式即ccc-DNA，DNA一条链的一个磷酸时为开环DNA分子（oc-DNA）DNA两条链中相对应的两个磷酸二酯键同时断开时为线形DNA（l-DNA） 拷贝数：指某目的基因在某一生物群体或个体中存在的个数. 单拷贝就是该基因在基因组中只有一个,多则指有多个。 不同构型质粒DNA电泳图 核酸分离纯化是原则：a保持核酸分子以及结构的完整性 b防止核酸的生物降解 核酸分离纯化的一般程序：材料的选择与预处理→破碎细胞与提取→分离纯化 DNA纯化最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子）、DNA沉淀可用玻璃棒挑或者离心沉淀 DNA凝胶电泳的影响因素：带电颗粒的物理性状，支持物介质，电泳强度，缓冲液离子强度 凝胶染色：EB液/SYBR GreenⅠ/Goldview 核酸分子杂交技术基本原理：具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特意地复性成双链 DNA的化学降解测序：经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测DNA分子的碱基序列（5→’3’） DNA序列的读取是逆电泳方向进行的 Sanger双脱氧链终止法读取的碱基序列是待测DNA模板的互补链，而非模板链本身 DNA纯化过程中的缺点：加剧DNA的丢失和损伤的可能性。Sanger中载体的存在不但不会影响测序的结果，反而有利于测序的进行，因为在实际操作中，引物往往不得与待测DNA的3’端互补，而是与载体克隆位点的两侧序列互补，这样可以测定完整的DNA序列 DNA测序通常包括克隆、测序反应和读序三个步骤， 1、DNA的分离与抽提：方法； 1.酚—氯仿抽提法 使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。 用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 1.减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。2.异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定 2.盐析法 3.氯化铯密度梯度离心法 4.