药用真菌新型固发酵工程对雷公藤解毒持效的初步研究.doc

药用真菌新型(双向性)固体发酵工程对雷公藤解毒持效的初步研究 [摘要] 目的:探索对有毒中药雷公藤缓解毒性保持药效的新技术。方法:应用/药用真菌新型(双向性)固体发酵工程0(双向发酵)的原理和方法,以雷公藤为药性基质、多种药用真菌为发酵菌种,构成多组发酵组合,在一定条件下进行固体发酵,取得不同药性菌质,用所建/发酵组合三层优选法0进行发酵菌种优选,并对当选优秀发酵组合用/发酵过程成分、药效动态比较法0初步建立它的发酵工艺。结果:已筛选出具有解毒并保持免疫抑制作用的2种发酵真菌即灵芝、槐耳和适当的发酵工艺。结论:药用真菌双向性固体发酵工程可用于研究开发解毒持效的雷公藤菌质。 [关键词] 双向发酵;雷公藤;解毒持效 雷公藤用于治疗类风湿性关节炎已有2 000多 年的历史,目前在临床上除应用于类风湿性关节炎 外,还用于肾病综合征、系统性红斑狼疮、器官移植 排斥反应、肿瘤等50多种疾病,尤其是在多种自身 免疫疾病的治疗中疗效明确而独特,是首选的中药 免疫抑制剂,但其临床毒副反应严重且发生率高,因 毒性太大限制了雷公藤的临床应用。为研究缓解它 的毒副作用并保持其疗效,作者组织力量于20世纪 90年代中期初步研究了雷公藤的生物技术处理,即 应用/药用真菌新型固体发酵工程0[1](简称/双向 发酵0,下同)进行雷公藤的解毒持效研究。以雷公 藤为药性基质,试与多种作为发酵菌种的药用真菌, 分别构成不同发酵组合,在一定条件下进行固体发 酵,用所建立的/发酵组合三层优选法0(即/3+1 优选法0)进行初步的发酵、化学、毒性、药效等研 究,优选出有效发酵菌种并又再设用一种/发酵过 程成分、药效动态比较法0帮助确定了它合理的基 本发酵工艺,获取了有效的药性菌质,为进一步进行 雷公藤生物技术解毒持效及其应用研究奠定基础。 1 材料 1.1 发酵基质(雷公藤) 雷公藤全根采自浙江,经江西中医学院罗光明 教授鉴定为雷公藤Tripterygium wilfordiiHooK. F., 以带皮的雷公藤全根作为药性基质,经60e烘干, 切片粉碎后定量装瓶(每瓶150 g),基质含水量约 135%, 121e高压灭菌2 h,冷却后接种发酵菌种。 1.2 发酵菌种 不同种类与作用的常见药用真菌22种。 2 方法 2.1 发酵菌种的筛选 运用/发酵组合三层优选法0。 2.1.1 菌种第一层初选 用22种药用真菌(无菌操作)分别接种于经灭 菌雷公藤药性基质上构成22组发酵组合, (26?1) e恒温,空气相对湿度75%,黑暗条件下进行固体 发酵,获得各种药性菌质。另设对照组CK1为未灭 菌处理的雷公藤生药材, CK2为经高温灭菌但未接 种菌种的雷公藤药性基质。以发酵组合的发酵性状 为指标,在适宜条件下组合双方能正常发酵并在适 当时间内产生合格菌质即能相互适应,此组合即其 菌质通过初选,否则即被汰除。 2.1.2 菌种第二层复选 用乙醇索氏提取雷公藤CK1及16组复选菌质 得清膏,分别将所得清膏按照薄层色谱法(5中国药 典61995年版附录)试验,吸取上述样品溶液各10 LL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以氯仿-乙 醚(2B1)为展开剂,展距8 cm,取出挥干溶剂,喷 10%的硫酸乙醇液,置紫外灯光下观察荧光斑点。 按菌质薄层色谱斑点位置及Rf值初步将菌质归类。 从每个类型中各选定1种菌质(菌种)为代表进入下一轮决选。 2.1.3 菌种第3层决选 复选菌种的发酵情况及4种菌质的化学 成分预试 将进入决选的4种代表菌种接种于灭菌 雷公藤基质上,测量菌丝体的生长速度、观察记录菌 种长满基质的时间以及对基质的消耗率和转化率, 了解4种菌种的发酵情况;同时对发酵后4种菌质 进行化学成分预试:即分别检测4种菌质及其CK1, CK2是否含有蒽醌类、强心苷类、黄酮类、有机酸类、 甾体类、三萜类、酯(内酯、香豆类)、糖类、生物碱 类、酚类、鞣质、氨基酸(多肽类、蛋白质类)、挥发油 等成分。以牛血清蛋白为参照指标,酚试剂显色,于 650 nm处测定样品吸收度,计算4种菌质和CK1, CK2蛋白质含量。用蒽醌-硫酸法测定糖类含量。 雷公藤及各种菌质清膏的急性毒性预实 验 昆明小鼠,雌雄各半,体重18~22 g,随机分 组,每组10只,设空白对照组。按0104 mL#g-1给 药体积灌胃雷公藤及各种菌质清膏, 1 d给药2次。 按照中药急性毒性实验方法[2]确定小鼠出现0%与 100%死亡的剂量,根据预实验结果,按1B0. 75或 1B0. 8剂间比配制各药5个剂量浓度(因药量限制, 各药只用3个剂量),给药后连续观察7 d,用改进 寇氏法计算小鼠LD50。 雷公藤及各种菌质对机体免疫功能的影 响[3] 因雷公藤有多个药效方向,本研究拟从其重 点药效即免疫抑制方向