生物成分的分离与测定技术学案.docVIP

第四章 生物化学与分子生物学技术实践 4.1生物成分的分离与测定技术（蛋白质的分离与纯化） 探究目的： 1、体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法 2、了解电泳法分离生物大分子的基本原理 探究预习： 实验操作程序 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化； ②血红蛋白的释放：使红细胞破裂，血红蛋白释放出来； ③分离血红蛋白溶液：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。 (2)粗分离 ①原理：透析袋能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内，透析可以除去样品中分子质量较小的杂质。 ②过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。 ③目的： ④图示： ⑤注意：透析时间为12 h。透析袋是用硝酸纤维素制成，小分子可自由进出，而大分子保留在袋内。 (3)纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。 (4)纯度鉴定：一般用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。 3．结果分析与评价 【解读步骤】 (1)红细胞的洗涤 ①采集血样→②低速短时间离心→③吸取血浆→④盐水洗涤→⑤低速离心→⑥重复④⑤步骤三次。 特别提醒 (1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的