原核表达实验流程.doc

原核表达流程： 第一步 目的基因获取 DH5a感受态制备 PCR扩增 pGEM-T载体 重组载体1 DH5a感受态细胞 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性 （阳性）转化细胞1 酶切，获取目的基因 Pet28a/DH5a载体 重组 重组载体2 第二步 重组载体2 DH5a感受态细胞 转化 转化细胞2 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性 （阳性）转化重组载体3 BL21感受态细胞 转化细胞3 诱导表达 蛋白质提取 SDS电泳检测呈阳性 目的蛋白 一.感受细胞的制备 体外连接的 DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA 的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和 CaCl2 法将外源DNA 导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2 感受态细胞。本实验制备的是电转化感受态细胞。 实验原理： 对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。 (109 ～ 1010转化子/μg DNA) 实验材料： LB 培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/l 胰蛋白胨，5g/l 酵母提取物，10g/l NaCl，加水至 1000ml，高压灭菌，保存在室温。无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/l 胰蛋白胨，5g/l 酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至 1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃培养 24小时，保存在室温。 10％甘油： 10ml甘油加入90m l ddH2O水，混匀，高压灭菌。 其他： DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加100ml LB液体培养基的500ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml离心管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。 实验仪器 酒精灯，超净工作台，温控摇床，4℃离心机等。 实验方法 (1) 将大肠杆菌DH5a 贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃培养箱过夜培养（培养好的平皿放入4℃冰箱贮存备用）。 (2) 从平板上挑取单菌落接种于5 mL无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；。 (3) 按照1:50比例接种过夜菌液至50 mL LB 培养基中，37℃剧烈振荡培养3小时左右，至OD600达0.3-0.6，最好是0.4 ； (4) 当OD600值达到0.4左右时，迅速将菌液冰浴15~30 分钟，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。（为获得最大效率的转化，在整个操作过程中菌液的温度不超过4℃是关键，以下步骤务必在超净工作台和冰上操作） (5) 将细菌培养物转移至冰冷的50mL离心管中，4℃用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心15min，以回收细胞。倒去培养液，用40mL冰冷的纯水重悬沉淀。 (6) 4℃用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收细胞。倒去培养液，用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（甘油有保存细胞的作用） (7) 4℃用JA转