第五章 核酸的提取201108.pptVIP

第五章 核酸的提取分离 第一节 材料的获得 第二节 DNA的提取分离 1、基因组DNA的提取、分离与纯化。 2、质粒、细胞器等其他DNA的提取分离。 第三节、RNA的提取 第二节 DNA的提取二、质粒的提取分离 1、提取的基本问题： （1）质粒DNA的特性 ： 是细菌中分子量较小的双链环状DNA分子。 有自我复制的特性。 有三种分子构型：闭环，切口（一条链断裂），直线（两条链断裂）。 （2）提取的过程：细菌的培养、收获和裂解；质粒的纯化等步骤。 二、质粒的提取分离 细菌的培养： 有小量提取和大量提取的问题 （一般的酶切、PCR扩增只需要少量质粒，制作酶切图谱、测定序列、制备探针则需要大量的高纯度的质粒）。 大量细菌会造成提取物体积和粘稠度较大，不利于操作。需要选择高拷贝质粒（pUC质粒）或进行氯霉素扩增。 氯霉素扩增：扩增质粒的同时，抑制细菌的复制，从而提高的质粒的含量。 二、质粒的提取分离 细菌的收获和裂解： 一般细菌培养过夜即可离心收获。 裂解提取 裂解细胞。然后利用细菌DNA和质粒变性特点不同进行分离提取：质粒较小容易复性，且有较好的拓扑超螺旋结构帮助其抵抗变性和快速复性。 方法有很多种： 碱裂解（NaOH, SDS），煮沸裂解等。煮沸裂解不宜用于含糖量高的一些菌种的大量提取，否则提出的多糖不利于质粒的纯化。 二、质粒的提取分离 质粒的纯化： 氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法。 平衡密度梯度离心是在密度梯度介质中进行的离心，被分离的物质是依靠它们的密度不同进行分离的，此种离心常用无机盐类（如氯化铯CsCl）制作密度梯度。当被分离的物质分别达到与其密度相同的介质部位时就不再移动。 纯化处理：氯化铯CsCl密度梯度离心 氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心 溴化乙锭（EB）通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。 闭环质粒DNA：作为补偿，将在中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。 开环和线状分子：不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和( 每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子) 。导致其分子密度降低而达到与闭环分子分离的目的。 2.质粒DNA的小量提取——碱裂解法 3、质粒DNA的电泳检测 观察琼脂糖凝胶中DNA的方法是利用荧光染料溴化乙锭EB进行染色。 该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。 三、 细胞器DNA的提取分离 分离叶绿体DNA和线粒体DNA的原理基本一致。 首先分离完整的细胞器，然后从细胞器中提取细胞器DNA。 一般采用氯化铯和蔗糖梯度离心法和柱层析法。 第三节 RNA的提取分离 一、概述 RNA是基因表达的中间产物，也是基因表达的调节物质，同时也是RNA病毒的遗传物质。 完整RNA的提取和纯化, 是进行RNA的研究工作, 如 Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译研究等的前提。 1、RNA的种类 RNA主要有rRNA （80-85%），tRNA 及小分子RNA（15-20%），mRNA （1-5%）。 其他RNA： hnRNA（mRNA前体分子， 因分子大小很不均一，称核内不均一RNA(hn RNA)） SnRNA（核内小RNA，在hnRNA及rRNA的加工中有重要作用，snRNA参与mRNA剪接） SnoRNA（snoRNA参与rRNA成熟加工） ScRNA(细胞质小分子RNA)等。 mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白质，因此mRNA是分子生物学的主要研究对象之一，它的提取和分析就显得非常重要 。 2、提取过程中的关键点 １）保证有足够的量：样品细胞或组织的有效破碎。 ２）保证RNA的纯度：有效地使核蛋白复合体（RNP)变性；有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 ３）保证RNA不会被降解：对内外源ＲＮＡ酶的有效抑制。 3、RNA酶的特点和抑制 1）RNA酶含有肽链内二硫键，使其能抵抗长时间的煮沸和温和变性剂，具有很高的稳定性。 RNA酶可耐受多种处理(例如煮沸、酸、碱)而 不失活。 2）该酶活性的不依赖二价阳离子激活，难以被金属离子鳌和剂（EDTA）失活。 3）RNase存在广泛，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液和及唾液中均存在RNA酶。 抑制和破坏RNA酶活性 抑制RNA酶活性的试剂常用的有： 1）焦碳酸二乙酯（DEPC） 2）异硫氰酸胍(GIT) 3）RNA酶抑制蛋白（RNasin）等。 抑制RNA酶活性的试剂 1）DE