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第六章荧光光谱 Fluorescence 2008年诺贝尔化学奖 green-fluorescent protein (GFP) 荧光光谱的特点 荧光光谱灵敏度高的原因 荧光辐射的波长比激发光波长长，测量到的荧光频率与入射光的频率不同； 荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光成直角的方向上检测； 这样，荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用的样品量很少，且测量方法简便。 EMISSlON LlFETlMES 荧光光谱的基本原理 Fluorescence Fluorescence is emission from a singlet state, where the electron spins in the molecule are paired. 仪器结构 FLUORESCENCE INSTRUMENTATlON 荧光显微镜 环境对荧光参数的影响 天然荧光生色团和荧光探针 (Natural fluorophores and fluorescent probes) 判断荧光生色团的标准 判断化合物能否产生荧光，可以从以下几个方面来分析： 碳原子骨架：具有共轭双键体系的分子容易产生荧光。绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环。任何有利于?电子共轭度的结构变化都将提高荧光效率，或使荧光波长红移。 分子的几何排布：具有刚性平面结构的有机分子容易发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。 取代基的类型和位置。 环境、溶剂、温度、pH等均会影响分子结构，从而影响荧光。 生物化学中主要的荧光生色团 生物化学中主要的荧光生色团可分为两类: 天然荧光生色团 荧光指示剂（荧光探针） 主要的天然荧光生色团 蛋白质中的芳香族氨基酸 核黄素、维生素A、叶绿素等天然色素和NADH等少数分子 核酸中tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶） 蛋白质和核酸中的荧光生色团 荧光探针 对于作为荧光探针的分子有以下几个基本要求： 能产生稳定的，较强的荧光。 探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的结合，而且结合得比较牢固。 探针的荧光必须对环境条件较敏感。 结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。 Typical fluorescent probes Structures of some fluorescent probes 天然色素的内源荧光分析 维生素大多含有芳香环结构，本身具有较强的天然荧光，因此可以利用内源荧光检测维生素。例如，可用345nm激发，490nm处测量，用以确定血液中维生素A的含量。核黄素即维生素B2在pH7.0时，用激发波长370nm（或440nm），发射波长为565nm检测，可以确定组织中核黄素的总量。维生素B12在pH7的溶液中，可以用275nm激发，305nm处检测。维生素C用490nm激发，可产生绿色荧光（530nm）。 用荧光光谱测量光合效率 利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质的结构变化 氨基酰化酶在十二烷基硫酸锂作用下内源荧光发射谱随作用时间的变化,随作用时间的增加，荧光强度逐渐减小。表明随作用时间的增加，该蛋白质逐渐变性，发生去折叠，蛋白质内部的荧光生色团逐渐暴露在极性水环境中。 Normalized fluorescence emission spectra of DNA-bound cyanine dimers, identified by the color key on the sidebar. Analysis of DNA Structure, DNA Binding and DNA Damage Single Nucleic Acid Molecule Detection Nucleic Acid Conformational Analysis DNA Binding Assays ? Assessing DNA Damage Assays for Enzymes that Modify Nucleic Acids 光镊(optical tweezers) 光镊是以光的力学效应为基础发展起来的一种新型技术 用光镊可以实现对细胞、细胞器以至生物大分子进行非机械接触的、无损的捕获和操作。 光镊在生物学研究中的应用，大都与荧光技术密切结合。所研究的细胞或生物大分子往往采用荧光探针进行标记。例如，用荧光探针标记肌动蛋白，结合光镊技术，拍摄了单个“分子马达”的运动情况。 环境因素对荧光寿命的影响 碰撞淬灭 前面曾提到碰撞淬灭会降低荧光强度，碰撞淬灭也可能使荧光寿命缩短。例如前面提到的0.1M磷酸缓冲液，能使酪氨酸的荧光寿命从3.4 ns缩短到2.6 ns。 浓度与荧光寿命的关系 荧光生色团的浓度增加，荧光量子产率下降，但荧光寿命不一