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肺癌细胞A549 Livin基因在常见化疗药物作用下的表达和对细胞增殖的影响摘要:目的 研究化疗药物对人肺细胞癌A549抑制基因Livin基因的影响。方法 将不同化疗药物浓度按100、50、25、12.5、6.25、、3.13、1.56、0.78ug/ml,与A549共同培养,分别作用24、48、72h,MTT检测细胞凋亡结果;real time PCR检测Livin mRNA的表达,以及Western blots检测Livin蛋白的变化。结果 不同浓度化疗药物与A549培养后,细胞凋亡率与化疗的浓度增加而升高以及Livin基因的表达也明显的改变(P0.01)。结论 化疗药物通过抑制肺癌细胞A549 Livin基因表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。关键词:化疗药物;肺癌细胞;Livin基因随着吸烟人群的增加(包括吸入二手烟)及大气污染的加重,肺恶性肿瘤的发病率逐年增加;治疗目前除手术切除外,主要为化疗与放疗,但化疗药物的耐受性往往影响化疗药物的疗效;目前研究发现Livin基因与肿瘤的耐受性有一定的关系[1,2],因此,我们选用常见的化疗药物作用于肺癌细胞株,观察Livin基因表达的改变,探讨Livin基因与细胞凋亡的相互关系。1资料与方法1.1一般资料 江苏省无锡市人民医院肿瘤科提供化疗药物依托铂苷、卡铂、多柔比星。中科院上海生化与细胞生物学研究所提供人肺癌细胞株(A549)。1.2实验用仪器与试剂 96孔细胞培养板(Costar, Denmark);细胞培养箱(NAPCO,USA);倒置相差显微镜(OLYMPUS,JAPAN)。DMEM培养基(GIBCO,USA)(每L含10%小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg,青霉素100U、链霉素100U、pH7.4);胰蛋白酶(MERCK,USA);二甲基亚砜(DMSO)(Merck,Germany),无水乙醇(分析纯,上海振兴化学试剂厂,批号:365);Livin(abcam USA)、碘化丙啶(PI) (Sigma,USA),南京生物工程公司提供引物。1.3 方法1.3.1体外培养实验用细胞株 用含10%小牛血清的DMEM培养液培养、传代人肺癌细胞株(A549)。1.3.2 实验分组 正常对照组;依托铂苷、卡铂、多柔比星浓度按100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78ug/ml,与A549共同培养,分别作用24、48、72h。1.3.3 MTT法检测化疗药物对细胞活力的影响 使用0.25%胰酶消化培养至第3代的各组A549细胞后,吹制成单个细胞悬液(细胞密度为1.0×104),分别接种到96孔板中(不含细胞的血清(为消除血清物质对光吸收值的影响)(1~2列)、空白组细胞悬液(3~4列);模型组细胞悬液(5~6列);不同浓度的测试药物组细胞悬液(7~12列)),于37℃、5%二氧化碳的培养箱放置并作用24h、48h、72h后,每孔再加入MTT溶液20ul,继续孵育4h后终止培养。小心吸弃上清液,小孔加入DMSO 200μl溶解结晶物并振荡10min后在酶标仪上测定各孔的吸光值。1.3.4 RT-PCR 检测Livin mRNA的表达 根据美国NCBI 的Genbank 提供的Livin 和β-actin mRNA 序列, 设计引物序列如下: ①LivinSense: 5′-TGAGGAGTTGCGTCTGGC-3′;Antisense: 5′-GGCTGCGTCTTCCGGTTC-3′。②β-actin(BC004251) Sense: 5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′; Antisense: 5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR应体系均为15ul,其中含cDNA模板2.5ul,SYBR Green 7.5ul,引物 0.6ul,去离子水4.4ul,95℃预变性5min,94 ℃45sec,56℃45sec,72 ℃50sec,35个循环;比较Ct法(△△Ct法)分析结果。1.3.5蛋白印迹(Western blots) 分析 常规细胞蛋白质的提取、定量, SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。湿转法转膜后先后与5%BSA、一抗(浓度1∶1 000)、过氧化物酶偶联的二抗(浓度1∶10 000) 孵育, 运用ECF化学发光显影、荧光图像扫描仪扫描存入电脑。1.4数据分析 运用SPSS13.5统计软件,以均数±标准差表示,采用单因素方差分析及t检验。2结果2.1对A549细胞凋亡的改变 实验结果提示,A549细胞经化疗药物作用后,细胞的抑制明显增高(P0.01),并有剂量依赖性以及时间依赖性(见图1~图3)。2.2各化疗药物组细胞Livin mRNA的表达 RT-PCR结果显示,化疗药物多柔比星、卡铂与A549细胞分别
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