生化大实验生化大实验课件1幻灯片.ppt

[实验目的]： 通过超速离心分离血浆脂蛋白能够达到下列要求： 掌握超速离心技术的原理。 熟悉差速沉降离心法 、 密度梯度区带离心法中的差速区带离心法 和等密度区带离心法的机理、特点及应用。 了解制备性离心机分为哪几类、各自的特点及应用。 了解转头、离心管有哪些？各自的特点及应用。 了解梯度材料的选择原则及应用范围 掌握血浆脂蛋白的分离方法。 [实验原理]: 本实验采用正常人抗凝血浆，以NaBr为密度介质，利用各脂蛋白颗粒密度不同，经过超速离心大量制备低密度血浆脂蛋白。 离心分离技术 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物、天然的生物大分子、无机物、有机物。在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。 1.基本原理 离心力：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即： F = m·a = m·ω2 r a — 粒子旋转的加速度， m — 沉降粒子的有效质 ω—粒子旋转的角速度， r—粒子的旋转半径( cm )。 相对离心力：常用地球引力的倍数来表示，因而称为 相对离心力, RCF = m×a/ m×g= a/ g RCF = = 1.119×10－5×(rpm)2 r ( rpm —每分钟转数，r/min ) 由上可见，给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。 若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。 已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500×g即是RCF值。 RCF(×g)=1.119×10-5×r×rpm2。 2 离心分类 根据离心原理大致可分三类。 差速离心法 密度梯度离心 1）速率区带离心法 2）等密度离心法 沉降速度: 沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。 沉降时间:在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来的问题，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子所需的时间。 沉降系数:根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。 S = （1/ω2X）·（dx/dt）= d2（ρp-ρm）/18η 1S=10-13秒 式中,d为球形粒子直径；η为流体介质的粘度； ρp为粒子的密度； ρm为介质的密度。 从该式中可看出， （1）当ρp ρm，则SO，粒子顺着离心方向沉降。 （2）当ρp =ρm ，则S= 0，粒子到达某一位置后达到平衡。 （3）当ρp ρm ，则SO，粒子逆着离心方向上浮。 2.1差速沉降离心法 采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。 2.2密度梯度区带离心法 ： 区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 密度梯度区带离心法又可分为两种： ①差速区带离心法 ②等密度区带离心法 2.2.1差速区带离心法： 不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。 此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。 离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大 但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。 2.2.2等密度离心: 离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度