实验紫外分光光度法测定蛋白质含量.pptVIP

分光光度法 分光光度法的原理 Lambert-Beer定律（光吸收定律） 溶液的质量浓度（C）越大，液层厚度（L）越厚，则溶液对光线吸收得越多。 当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即K吸光系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光物质的浓度成正比。 所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的含量。 入射光 I0 出射光 It 反射光 Ir Ia 吸收光 It／I0 ＝ T T （ transmittance ）称为透光度 ，表示透过光的强度是入射光强度的百分比。 A∝C 光密度与浓度成正比 T与C成反比，浓度愈大，T愈小 A= - lg = KCL T A （Absorbance）称为吸光度，指溶液对光线的吸收程度又称为光密度（Optical density， OD ）。 分光光度法的应用 用标准管法计算待测液浓度 在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），及未知浓度（CU）溶液的吸光度（AU），根据定律得：  AU=KUCULU ； AS=KSCSLS 因为KU=KS， LU=LS 所以AS与AU之比值也等于两浓度之比值 即 AU/AS=CU/CS ， CU= AU AS ×CS 分光光度法的应用 用标准曲线法求出待测溶液的浓度 先配制一系列已知浓度的测定物溶液，分别测得各管的吸光度。以各管吸光度为纵坐标，测定物含量为横坐标；在方格坐标纸上作图即得标准曲线图。 吸光度A 蛋白质浓度C（μg/ml） 0.2 0.4 0.6 . . . . 40 80 120 160 分光光度法 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。 特点：分光光度法灵敏度较高、精确度高、操作简便、快速。 分光光度法所使用的光谱范围主要是波谱图中200～1000nm为一段波长的光谱。 紫外光区200～400nm 可见光区400～760nm 红外光区760～1000nm 分光光度计的基本结构 光源 单色 光器 吸收池 测光 机构 钨丝灯 氢灯 氘灯 棱镜 衍射光栅 玻璃比色杯 石英比色杯 硒光电池 光电管 光电倍增管 将光能转变为电能，光电流的强弱与溶液的吸光量强弱有关。 开机，预热20~30分钟 转动波长旋钮，调所需波长。 调零 测量并读数 结束/关机 清洗比色杯，收拾好仪器及配件，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。 分光光度计使用的注意事项 试管架或试剂瓶不得放置于仪器上，以防试剂溅出腐蚀机壳。 拉杆动作要轻，防溶液溅出，腐蚀机件。 比色杯应与分光光度计相配对，禁止随意挪用。 比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。 盛液时不能太满（约达比色杯2/3体积），外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。 测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。 原 理 大多数蛋白质都含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。这些氨基酸有苯环共轭双键，在紫外光区280nm显示最大光吸收，且吸光度与浓度成正比。 蛋白质定量——紫外分光光度法 试剂配制表（ml） 试管 0 1 2 3 4 5 标准蛋白质溶液（1mg/ml） —— 0.5 1.5 2.5 4.0 1.0（待） 蒸馏水 4.0 3.5 2.5 1.5 —— 3.0 浓度 0 0.125 0.375 0.625 1 A280 蛋白质定量——紫外分光光度法 1.标准管法（以第三管为标准管） 蛋白质定量——紫外分光光度法 结果处理 A测 A标 × C标 ×4（稀释倍数） C测= 2.标准曲线法 以标准管浓度为横坐标，标准管吸光度为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。根据待测管的吸光度，从标准曲线上查出待测溶液的浓度并乘以稀释倍数。