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做好免疫组织化学染色的几个注意点 　　摘要：免疫组织化学染色方法是根据抗原抗体特异性结合，通过荧光或化学显色检测细胞或组织中抗原的含量和分布，具有特异性强、灵敏度高和定位准确等特点。本文主要从抗体孵育条件、设置合理对照、固定液的洗脱、抗原修复和洗片等步骤讨论如何做好免疫组织化学染色。 　　关键词：免疫组织化学染色；抗体；组织固定；抗原修复 　　免疫组织化学染色方法是目前生命领域研究最常用的实验方法之一，也是临床病理诊断从细胞形态水平提高到分子水平的关键技术环节。免疫组织化学染色方法主要应用免疫学中抗原抗体结合的实验原理检测特定抗原在细胞或组织中的表达和分布。影响免疫组织化学染色的因素有很多，而抗体孵育条件、设置合理对照、固定液的洗脱、抗原修复和洗片等可能是做好免疫组织化学染色的关键注意点。 　　1基本原理及特点 　　免疫组织化学染色方法是根据免疫学中抗原抗体特异性结合，通过荧光或化学显色检测细胞或组织中抗原的含量和分布。免疫组织化学染色法具有特异性强、灵敏度高和定位准确等特点。目前最常用的几种免疫组织化学染色方法主要包括免疫荧光法、免疫酶标法和免疫胶体金技术等。免疫荧光法是将荧光素标记的二抗和一抗结合，可在荧光显微镜下直接观察细胞或组织内相应抗原的表达和分布。免疫酶标法与免疫荧光法不同之处在于二抗的标记方式，它用酶标二抗代替荧光素标记的二抗，然后通过加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，然后通过光镜或电镜，观察细胞或组织内抗原的含量和分布。免疫酶标法包括二步法、ABC法、SP三步法等多种方法，由于其组织形态较为完整，在抗原定位上对免疫荧光法具有更大的优势。 　　2几个关键注意点 　　2.1抗体孵育条件 抗体孵育是免疫组织化学染色中最关键的步骤，也是最核心的步骤。一个失败的免疫组化实验结果大部分都与抗体孵育条件不佳有关。抗体孵育条件包括抗体稀释浓度、孵育时间和温度、抗体稀释液等因素。即便是同一个抗原，在不同组织中表达丰度也有很大的差异，因此一定要根据浓度梯度选择合适的抗体稀释浓度。一抗孵育温度包括4℃、室温和37℃，4℃反应较为温和，效果最好。一般可选择4℃过夜，然后37℃复温30min～1h。二抗孵育条件一般室温2h。室温一般定义为25℃，如果在夏天或冬天选择室温孵育，需要注意室温的温度。可以用添加5%二抗来源血清的PBS稀释抗体，如果抗原位于细胞质或细胞核，建议用含5%二抗来源血清的TBST稀释抗体。由于弱碱性条件有利于抗原抗体结合，因此一定要注意抗体稀释液的PH值在7.2～7.4之间。此外，为了防止抗原抗体反应时液体的蒸发，可在擦干组织周围的液体后，使用免疫组化笔在组织周围画圈，使抗体不易流失，抗原抗体的反应过程中不干片，保证结合效率。 　　2.2设置合理对照 由于免疫组织化学染色中影响抗原和抗体结合的因素很多，因此必须设置对照组才能做出正确的判断。常用的对照包括：阳性对照、阴性对照和空白对照等。阳性对照是用已证实含用待测抗原的组织进行同样操作，结果应为阳性。通过阳性对照可排除染色步骤以及所用的试剂的问题。用确知不存在待检抗原的组织切片染色为阴性对照，可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的假阳性结果。空白对照是最常用的对照，用不加一抗的缓冲液，如PBS替代一抗，染色结果应为阴性，说明染色方法可靠，可排除组织的的非特异性显色或荧光。 　　2.3固定液的洗脱 取材新鲜、固定及时，不仅可保存组织细胞形态结构的完整，而且可保留组织细胞的抗原性。固定液的选择将直接影响免疫组化标记的结果及病理诊断的准确性[1]。然而，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水和染色。由于免疫组织化学染色需要组织保存较高的抗原活性，因此一般选用PBS对固定的组织进行浸洗，30min/次，连续浸洗3次。 　　2.4抗原修复固定和石蜡包埋 可使组织部分抗原决定簇与核酸或其他蛋白发生交联，如果不进行抗原修复可能会得到假阴性实验结果。常用的修复方法包括高压修复、微波处理法和酶消化法等。通过微波抗原修复，充分暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体结合，提高实验结果的准确性。一般可用微波中火修复4次，5min/次，抗原修复液需预热至修复时所需的温度。在微波修复过程中，应注意抗原修复液的蒸发，必须保证组织浸于液面以下，否则易造成假阴性结果。如果液体蒸发较多，可在中间及时加入预热的抗原修复液。微波修复后需自然冷却至室温，一般需要30min～1h。抗原修复液的pH值对染色结果有很大影响[2，3]。抗原修复液一般采用酸性的柠檬酸修复液，酸性pH值的抗原修复液效果要好于碱性修复液，并且不易造成脱片。此外，丙酮简单处理标本是一种方法简单、又能使组织免疫反应活性得到明显加强的方法，有时可替