第6章 电泳法技术.pptVIP

* 二、凝胶性能及制备 3、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 * 三、蛋白质染色 1、氨基黑10B λmax=620-630nm，酸性染料。其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料之一，但对SDS-蛋白质染色效果不好。另外，氨基黑10B染不同蛋白质时，着色度不等、色调不一(有蓝、黑、棕等)；作同一凝胶柱的扫描时，误差较大。 * 三、蛋白质染色 2、考马斯亮蓝R250 λmax=560-590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。该染料是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超过一定范围时，对高浓度蛋白质染色不合乎Beer定律，作定量分析时要注意这点。 * 三、蛋白质染色 3、考马斯亮蓝G250 G250比R250多二个甲基。λmax=590-610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。其优点是在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地使蛋白质染色而几乎无本底色，所以常用于重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。 * 三、蛋白质染色 5、银染法 较R250灵敏高100倍，适于微量样品分析。但染色机制尚不清楚，可能与摄影过程Ag+的还原相似。其灵敏度很高，牛血清为4×10-5μg/mm2，即清蛋白为8×10-5μg/mm2，cyt C为1.7×10-4μg/mm2，因此也常用于凝胶电泳蛋白质染色。 * 四、装置 * 五、操作过程 1. Vertical Slab Gel Unit 2. Inserting the spacer 3. Attaching the clamp 4. Assembling the gel casting strand * 五、操作过程 5. Mixing the gel under vacuum 6. Polymerized resolving with water overlay 7. Inserting comb into ‘stacking gel’ 8. Removing comb from ‘stacking gel’ * 五、操作过程 第六章 电泳技术 * 基本要求 1 概述 2 基本原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳 内 容 提 要 SDS电泳 等电聚焦电泳 6 3 4 5 * 基 本 要 求 一、掌握电泳的基本原理； 二、掌握聚丙烯酰胺电泳和SDS电泳的原理 及方法； 三、熟悉等电聚焦电泳的原理。 * 电泳——带电粒子或离子在电场作用下的定向移动，依据带电粒子在电场作用下迁移行为不同进行分离的技术称为电泳(electrophoresis)。 概 述 * 1808年俄国物理学家Peнce首先发现了电泳现象。当时多用于胶体化学的分析。 1937年Tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳，以界面折光率差别分离蛋白，即界面电泳。 1948年 Wieland等发明以滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化。 近30年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置不断改进，出现了许多新型的电泳技术。 发展简史 * (一) 分类 1、按其原理不同可分为： (1)移动界面电泳 (2)区带电泳 (3)等速电泳 (4)等电聚焦电泳 * AB + B A B A AB B A ABC C B A 移界 区带 A B C 等速