样品处理技术6凝胶层析.pptVIP

凝胶与色谱柱 凝胶过滤是利用多孔凝胶固定相为基质，依据分子尺寸大小形状的差异来进行分离的方法，又称为体积排阻色谱、分子筛色谱，很适合用于蛋白质酶解物的粗分离。 凝胶色谱常用葡聚糖凝胶如Sephadex G-15、G-25或聚丙烯酰胺凝胶Bio-gel P-2、P-4、P-6、P-10作基质，常用的色谱柱有TSK G2000SW、 Bio-Sil SEC125、Zorbax GF-250、Protein-Pak60、Bio-Sep-SEC2000等。 操作步骤1：选择凝胶 凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15 操作步骤2：选择柱子 柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。 操作步骤3：凝胶溶胀 凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。 自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 操作步骤4：凝胶的装填 将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。 平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。 操作步骤5：上样 加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。 一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。 样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。 操作步骤6：检测 自动检测仪、自动部分收集器 实验举例 实验目的:测定蛋白分子量\收集目标蛋白 实验方法:凝胶层析法 （１）材料、试剂与仪器、设备 1.葡聚糖凝胶（Sephadex）G-25 2.凝胶柱 3.梯度混合器 4.调节阀 5.恒流泵 6.自动检测仪 7.自动部分收集器 8.Tris-HCl缓冲液 另:标准肽：牛血清白蛋白（MW=67000），抑肽酶（MW=6500），杆菌肽（MW=1450），阿斯巴甜（MW=294） 标准肽洗脱曲线 * 、 贮液缸 凝胶柱 调节阀 恒流泵 检测器 自动部分收集器 凝胶层析装置示意图 *