2福林(Folin)-酚试剂法测定.ppt

福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度 一、原理 蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。 二、实验仪器 1.卵清蛋白片 2.7220分光光度计 3.试管 4.移液管 三、实验试剂 1.Folin-酚试剂A：碱性铜溶液 甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中 乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。 临用时按甲：乙=50：1混合使用。 2.Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。 3.500ug/mL卵清蛋白液：称取0.5g卵清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至 1000ml 四、实验步骤 1.标准曲线的绘制 取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。 2.样品测定 准确吸取样液1.0ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。 附：7200型分光光度计的操作程序 连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。 接通电源，使仪器预热20分钟。 用MODE键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式。 用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。 将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。 将0％T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0％T”键，此时显示器显示“000.0” 按 MODE键选择A模式 将参比样品拉入光路中，按“0A/100％T”键调0A/100％T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。 当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样品的吸光度。 * * OD500 摇匀，在室温下放置30分钟后在500nm下比色 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin-酚试剂B 摇匀，在室温下放置10分钟 0.5（样液） 0 4.0 0.5 0 4.0 0.4 0.1 4.0 0.3 0.2 4.0 0.2 0.3 4.0 0.1 0.4 4.0 0.05 0.45 4.0 0 0.5 4.0 卵清蛋白液ml 蒸馏水ml Folin-酚试剂A 样品 7 6 5 4 3 2 1 管号 *