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mRNA差异显示方法研究进展 [关键词] DD--PCR　骨科学 研究 : 马庆军　1000083 北京医科大学第三三医院骨科 1000083 北京医科大学第三三医院骨科 哺乳动物物细胞约有100?000个个不同的基因，在一定时间、、空间中仅有10％～15％％的基因表达，这种表达受到到严格调控［1］。运用mRRNA 差异显示（diffferential dissplay,DD）方法［22］，可将不同细胞类型或同同一细胞在不同环境下表达的的基因进行比较，从分子生物物学水平上提供信息，这对理理解细胞的生命过程极有帮助助。该技术一经问世，立即得得到广泛应用，但同时也遇到到许多问题，所以Debouuck［3］曾对该方法提出出质疑。现将DD的研究进展展简要综述如下。 DDD方法基本原理 DD的基本本原理是将具有可比性的细胞胞在某一条件下可表达的mRRNA 群体通过逆转录方法法变成相应的cDNA 群体体，以此为模板，利用一对特特殊引物，即3oor 引物和5ttrary引物，在一定条件件下进行PCR扩增，得到与与mRNA相对应的“标签””（tags），然后用变性性聚丙烯酰胺测序胶分析其差差别，将有差别的基因克隆化化，进一步分析其结构与功能能。DD依赖三种技术：（11）mRNA逆转录技术；（（2）以特定引物进行的PCCR技术；（3）DNA测序序胶电泳技术。 DD方方法的优点及其应用 mRNA表达的的差异，至少要满足下列要求求：（1）在一定时间、空间间里，每一个细胞约有15 000种mRNA表达，其其中除少数属高丰度表达外，，大量的属于低丰度表达，即即要求使用的方法足以显示低低丰度mRNA；（2）重复复性要好；（3）实验过程中中能够步步验证比较（sidde-by-side coomparison）；（44）得到的产物能代表相应的的mRNAs或cDNAs，，并能由此找到相应的cDNNA 序列；（5）省时，简简便易行。 　　 既往对mmRNA的比较研究中多用减减数杂交方法［4］（subbtraction hybbridization），，该方法灵敏，可显示低丰度度RNA，但是步骤复杂，需需时较长，而且在得到最终结结果前无法步步验证对照比较较，故不易重复，并且需要大大量的RNA作起始研究材料料。这一点对RNA来源不易易者（如手术活检标本）极不不利［5，6］。 　　DDD的优点在于：（1）仅需 μg总RNA作为起始材料料；（2）可同时分析多组样样品；（3）敏感性高，可检检出低丰度mRNA；（4））实验周期短，约8天即可完完成［7］，便于重复；（55）最突出的优点是实验过程程中可步步验证比较。可简单单地将DD的特点概括为“33SRV”，即“Simpllicity，Sensittivity，Speed，，Reproducibillity，Versatillity”。 　　DD方法法因有上述优点，被广泛应用用。例如：Musholt等等［8］应用DD方法对手术术切下的髓样甲状腺癌标本与与局部转移的淋巴结进行了比比较，发现了两个新的表达基基因MDF-1和MDF-22，并认为这两个基因在髓样样甲状腺癌的进展与转移中起起了重要作用；Zuo等［99］研究溃疡性结肠炎的粘膜膜细胞，以正常结肠粘膜细胞胞作对照，找到了25个表达达基因，其中有些与甲状旁腺腺瘤、T细胞受体-β、卵巢巢癌等表达的基因同源。 　　　关于神经再Liivesey等［10］发现现了Reg-2基因，并认为为该基因是哺乳类动物运动神神经元再生的关键基因。 　　　在骨科领域，也有许多用用DD方法的研究，Ryooo等［11］找到了一个与成成骨细胞表型发育有关的细胞胞增殖标志基因PROM-11（proliferatiing cell markker）。更令人鼓舞的是，，Boden等［12］用一一种新的骨形成蛋白LMP--1基因转染骨髓细胞，再作作局部基因治疗，在动物实验验中成功地进行了脊柱融合，，LMP-1基因就是用DDD方法克隆出来的。 　　此此外，DD还应用于心血管病病［13］、糖尿病［14］］、胚胎发育［15］、先天天性疾病［16］以及药理学学［17］和眼科学［18］］等。不仅用于动物和人类，，还应用于植物分子生物学研研究［19］。 DD方法存在在的问题概括起来有两方面：：一是假阳性多（约50％～～70％），二是得到的有差差异cDNA片段短（约为1110～500 bp）。因因为这两个问题，使许多研究究者踟蹰不前，这也是Debbouk［3］提出质疑的原原因之一。 　　产生假阳性性的原因，在于以下4个环节节：（1）提取总RNA时，，有染色体DNA污染，此DDNA作为模板在PCR过程程中被扩增；（2）从聚丙烯烯酰胺胶上挑选有差异条带时时，实验组与对照组间信号对对比不够显著；（3）在克隆隆阶段挑选阳性