生物化学第三章核酸的结构与功能.ppt

3.7.4 核酸的变性 在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂。 破坏了氢键和碱基堆积力，使核酸分子高级结构改变、理化性质及生物活性发生改变，不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变。 变性后，260nm的紫外吸收值明显增加，即产生增色效应 DNA的变性 核苷酸骨架上3′，5′-磷酸二酯键的断裂称为降解 DNA解链时的紫外吸收变化 完全变性后核酸紫外吸收值增加： 天然DNA↑25~40%、RNA↑约1.1% 实质：碱基暴露 RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显 热变性 变性过程是“跃变式”的，而非渐变 如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。 变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度（melting temperature, Tm）。 Tm的影响因素 ① G-C对含量 G-C对含3个氢键，A-T对含2个氢键，故G-C对相对含量愈高，Tm亦愈高 ② 溶液的离子强度 离子强度较低的介质中， Tm较低。在纯水中，DNA在室温下即可变性。需核酸变性时，常采用离子强度较低的缓冲溶液。 ③ 溶液的pH 高pH下，碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力，pH大于11.3时，DNA完全变性。pH低于5.0时，DNA易脱嘌呤，对单链DNA进行电泳时，常在凝胶中加入NaOH以维持变性状态。 ④ 变性剂 甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。对单链DNA进行电泳时，常使用上述变性剂。 3.7.5 核酸的复性 当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺旋结构，这一现象称为DNA复性（renaturation） 。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火（annealing）。 减色效应：DNA复性时，其溶液A260降低。 （1）Tm为25℃为较适合的复性温度 （1）单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。 （2）较大的单链片段扩散困难，链间错配频率高，复性较慢。 （3）片段内的重复序列多，则容易形成互补区，因而复性较快。真核DNA的重复序列就是通过复性动力学研究发现的。 （4）维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度。 复性影响因素 3.7.6 核酸的分子杂交 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链（heteroduplex） 杂交双链可以在DNA与DNA链之间形成，也可在RNA与DNA链之间形成 杂交的本质：一定条件下使互补核酸链实现复性　 利用探针（probe）与靶DNA杂交，可识别靶DNA中的特异核苷酸序列 探针：探针是指带有某些标记物（如放射性同位素 32P ，荧光物质异硫氰酸荧光素等）的特异性核酸序列片段 杂交双链可以在DNA与DNA链之间形成，也可在RNA与DNA链之间形成。 Southern印迹（杂交） ① DNA的电泳 ② 电泳结果的凝胶上的DNA条带转移到硝酸纤维素早滤膜（醋酸纤维素滤膜）上 ③ 将滤膜上的DNA变性后固定 ④ 将变性的DNA滤膜在适当条件下与探针杂交 ⑤ 杂交结果的显示 Northern印迹（杂交） 是将RNA分子从凝胶转移到硝酸纤维素膜或其它化学修饰的活性滤纸上，从而进行核酸杂交的一种实验方法。 Western印迹法 基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所的位置。 杂交与PCR结合，能够检出含量极低的DNA 在现代分子生物学实验中，探针的制备和使用是分子杂交技术的基础，核酸分子杂交作为一项基本技术，已应用于核酸结构与功能研究的各个方面 医学上，分子杂交技术主要用于： ?遗传性疾病的基因诊断（gene diagnosis） ?恶性肿瘤的基因分析 ?传染病病原体的检测 其他方面 研究DNA分子中某一种基因的位置 测定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础 3.8 核酸序列的测定 目前应用的两种快速序列测