蛋白质表达经验.docVIP

如何做原核表达之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是 国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年 的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建 有62个生产基地。Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达 系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。pET系列 载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理 见下图。T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的 元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的 转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因 的转录能达到很高的水平。T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚 合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是λ噬 菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5