重组抗人表皮生长因子受体（EGFR）嵌合单克隆抗体CH225非还原电泳纯度分析.docVIP

重组抗人表皮生长因子受体（EGFR）嵌合单克隆抗体CH225非还原电泳纯度分析 　　【摘要】 目的：分析CH225在非还原电泳时抗体条带主条带以外在高分子量和低分子量产生杂条带的原因。方法：在不同的供试品缓冲液和不同电泳条件下进行SDS电泳比较。结果：上样前100 ℃煮样1 min与加碘乙酰胺结果相同。结论：高分子量和低分子量杂条带可以用电泳上样前100 ℃煮样1 min消除即可。 　　【关键词】 非还原SDS； 重组单抗； EGFR； 重组抗人表皮生长因子受体 　　药品生产过程中，重组蛋白类药物的质量检测和控制十分重要，SDS（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是蛋白类药物的纯度分析的常用手段[1-2]。CH225（重组抗人表皮生长因子受体（EGFR）嵌合单克隆抗体）是四川恒星生物制药有限公司采用基因工程技术，利用NS/0细胞表达的人源化抗体，属于IgG1亚型，已用于转移性结直肠癌、头颈癌等多种癌症的治疗，并且现有研究表明可能适用于鼻咽癌、肺癌等其他癌症的治疗[3-4]。在CH225的临床前研发，质量检测的过程中发现，除抗体主条带以外，还存在一些分子量大小不同的杂条带，特别在非还原性实验中，情况尤为明显。本文采用不同温度和不同试剂的条件下对样品进行预处理，比较最佳的SDS结果，为CH225批量生产的质量检测和控制提供参考和依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 药品 参比品（批号C201105002）：四川恒星生物制药有限公司于2011年5月第2批生产的CH225注射液；对照品（批号C201107006）：四川恒星生物制药有限公司于2011年7月第6批生产的CH225注射液；爱比妥（Erbitux）：通用名西妥昔单抗（cetuximab），默克公司生产。 　　1.2 主要试剂和仪器 SDS电泳装置和扫描仪为Bio-Rad公司产品；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。 　　1.3 缓冲液的配制 还原型SDS供试品缓冲液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚蓝，4% SDS，200 mmol/L DTT；非还原型SDS供试品缓冲液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚蓝，4% SDS；天然供试品缓冲液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚蓝；加碘乙酰胺的非还原SDS供试品缓冲液（2×）：向上述非还原SDS供试品缓冲液中加入新鲜配制的1 mol/L碘乙酰胺母液，至终浓度为200 mmol/L。 　　1.4 实验过程 　　1.4.1 70 ℃与100 ℃水浴非还原SDS分析 C201105002（参比品）、稀释至2 mg/mL与2×非还原SDS供试品缓冲液等体积混合，70 ℃分别水浴1、3、5 min后，立即转入冰浴。另取相同样品加入与2×非还原SDS供试品缓冲液等体积混合，100 ℃分别水浴1、3、5 min，立即转入冰浴。再取相同样品加入2×非还原SDS供试品缓冲液等体积混合，不经水浴。分离胶浓度8.0%，10 μL/孔上样，100 V电压开始电泳，待指示剂前沿进入分离胶后，电压改为150 V。电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝R250染色[5]。 　　1.4.2 普通非还原SDS与天然SDS分析 C201105002（参比品）和Erbitux样品均稀释至2 mg/mL与2×非还原SDS供试品缓冲液等体积混合，分别70 ℃水浴3 min、100 ℃水浴1 min后，立即转入冰浴。分离胶浓度8.0%，10 μL/孔上样，100 V开始电泳，待指示剂前沿进入分离胶后，电压改为150 V。另取相同样品加入天然供试品缓冲液后不进行加热变性处理，直接进行SDS电泳。再取相同样品加入2×非还原SDS供试品缓冲液等体积混合，不经水浴进行电泳。电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝R250染色[5]。 　　1.4.3 添加碘乙酰胺的非还原SDS分析 C201105002（参比品）、C201107006和Erbitux样品均稀释至2 mg/mL，分别加入2×非还原SDS供试品缓冲液或加碘乙酰胺的2×非还原SDS供试品缓冲液，混匀后，70 ℃水浴3 min。分离胶浓度8.0%，上样量10 μL，采用室温条件下150 V恒压电泳。电泳结束后，SDS凝胶用考马斯亮蓝R250染色[1]。 　　2 结果 　　2.1 70 ℃与100 ℃不同时间水浴非还原SDS分析 70 ℃分别处理1、2、3 min的样品电泳结果的相对分子量小的次带依次减少，70 ℃ 3 min相对分子量小的次带已基本不可见；100 ℃ 1、2、3 min时相对分子量小的次带有增加趋势，100 ℃ 1 min时相对分子质量小的次带已基本消失；未经水浴的条带出现多个杂的相对分子低的次带