芪蛭益肺药物血清对转化生长因子―β1刺激下肺成纤维细胞中基质金属蛋白酶及其抑制剂基因表达的影响.docVIP

芪蛭益肺药物血清对转化生长因子―β1刺激下肺成纤维细胞中基质金属蛋白酶及其抑制剂基因表达的影响 　　摘要：目的 观察芪蛭益肺药物血清对肺成纤维细胞中基质金属蛋白酶（MMP）-9及其抑制剂-1（TIMP-1） mRNA表达的影响，探讨其作用机制。方法 采用胰酶消化法提取大鼠肺组织成纤维细胞，培养至第4代后随机分为空白血清组、模型组和药物血清组。模型组与药物血清组先滴加含0.002 5 μg/mL转化生长因子-β1（TGF-β1）的DMEM，空白血清组滴加新鲜无血清DMEM，随后空白血清组、模型组滴加含5%空白血清的DMEM，药物血清组加入5%含芪蛭益肺药物血清的DMEM。培养48、72 h后，采用行实时荧光定量PCR法检测各组细胞MMP-9、TIMP-1 mRNA表达。结果 与空白血清组比较，培养48 h后模型组和药物血清组成纤维细胞中MMP-9、TIMP-1 mRNA表达上升，差异有统计学意义（P0.05），药物血清组和模型组之间比较差异无统计学意义。与空白血清组比较，培养72 h后模型组MMP-9 mRNA表达上升；与模型组比较，培养72 h后药物血清组MMP-9 mRNA表达下降，差异均有统计学意义（P0.05）；TIMP-1 mRNA表达3组间比较差异无统计学意义。结论 芪蛭益肺颗粒药物血清能够抑制TGF-β1刺激后肺成纤维细胞中MMP-9 mRNA高表达。 　　关键词：慢性阻塞性肺疾病；细胞培养；转化生长因子-β1；肺成纤维细胞；芪蛭益肺药物血清 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.03.015 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）01-0050-03 　　目前，慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病机制不明，缺乏有效地治疗药物，其发病率和死亡率仍在不断升高，预计到2030年将排在引发死亡所有疾病的第4位[1]。不可逆的气流受限是COPD的主要特征，与气道慢性炎症和组织重塑有关。基质金属蛋白酶（MMPs）能够水解一种或多种细胞外基质（ECM），参与调节机体免疫，并与基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPS）共同调控ECM的动态稳定，与组织重塑关系密切。因此，调节MMPs及TIMPs表达可视为治疗COPD的有效途径。肺成纤维细胞是参与COPD发病的重要细胞之一，转化生长因子-β1（TGF-β1）在所有参与发病的细胞因子中处于中心位置。本实验通过体外研究观察芪蛭益肺药物血清对TGF-β1刺激成纤维细胞后基质金属蛋白酶（MMP）-9及其抑制剂（TIMP-1）mRNA表达的影响。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　出生2～3 d SD红皮鼠30只，用于肺成纤维细胞提取，北京维通利华实验技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2006-0009。清洁级Wistar大鼠20只，用于血清制备，鼠龄2个月，体质量（250±20）g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2009-0007。 　　1.2 药物 　　芪蛭益肺颗粒由北京中医药大学东直门医院提供，批准文号：（98）京卫药制字052，批号101220。 　　1.3 试剂与仪器 　　DMEM基础培养液（高糖型CM15019），购于迈晨科技（北京）有限公司；TGF-β1 （T7039-2 μg）购于美国Sigma-aldrich公司。Trizol RNA提取试剂，购自Invitrogen公司；M-MLV逆转录酶购自Promega公司；SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒购自Roche公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。培养箱：MCO-20AIC SANYO Elecronic.Ltd.， JAPAN；电热恒温水箱：HH.W21.420；低速离心机：LD5-2；台式灭菌器：SANYO MLS-3780；十万分之一精密电子分析天平：日本岛津AEC-45SM；高压消毒锅：SANYO autoclave MLS-3780，JAPAN；烘干机：上海福玛实验设备有限公司。LightCycler 2.0实时荧光定量PCR仪：Roche诊断公司。 　　2 实验方法 　　2.1 血清制备 　　20只大鼠适应性喂养5 d，随机分为空白血清组和药物血清组，每组10只。药物血清组大鼠每日上午以6倍成人剂量按1.2 mL/100 g灌胃含芪蛭益肺颗粒溶液1次，约合0.3 g原药材/100 g；空白血清组灌胃等体积0.9%氯化钠溶液。各组连续灌胃7 d，第8日禁食，于第9日上午处死各组大鼠。腹主动脉取血，注入4 mL生化管中，每只取血约8 mL，3000 r/min离心10 min，超净台下吸取管中上清至新管中，4 ℃过夜，56 ℃水浴箱