止消通脉宁对转化生长因子―β1诱导的人肾小管上皮细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及纤连蛋白mRNA表达的影响.docVIP

止消通脉宁对转化生长因子―β1诱导的人肾小管上皮细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及纤连蛋白mRNA表达的影响 　　摘要：目的 探讨止消通脉宁含药血清对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（Col Ⅲ）和纤连蛋白（FN）mRNA表达的影响。方法 将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养基培养，分为空白对照组、TGF-β1诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）、空白血清对照组（TGF-β1 10 ng/mL+10%空白血清）、干预1组（TGF-β1 10 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁含药血清）、干预2组（TGF-β1 10 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁含药血清）、干预3组（TGF-β1 10 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁含药血清）。药物干预24 h后，荧光定量PCR检测ColⅠ、ColⅢ和FN的mRNA表达。结果 HK-2细胞经TGF-β1诱导后，ColⅠ、ColⅢ和FN的mRNA表达显著上升，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P0.05）。经止消通脉宁含药血清干预后，其表达逐步下降，与单纯TGF-β1诱导组比较，差异有统计学意义（P0.05）。空白血清无此作用。结论 止消通脉宁在一定程度上能够抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞ColⅠ、ColⅢ和FN的mRNA表达，减少细胞外基质成分的分泌，具有防治肾间质纤维化作用。 　　关键词：止消通脉宁；转化生长因子-β1；人肾小管上皮细胞；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原；纤连蛋白 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.013 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0033-03 　　基金项目：科技部国际科技合作项目（2009DFA31520） 　　通讯作者：刘铜华，E-mail：thliu@ 　　糖尿病肾病（DN）是糖尿病最为常见的慢性微血管并发症之一，其发病机制尚未明确。既往认为DN的早期病变部位在肾小球，近年来研究发现肾小管病变及肾间质纤维化与其关系更 　　为密切[1]。肾间质纤维化是所有肾脏疾病发展到终末期的共同病理基础，其特征是细胞外基质成分的过度沉积。因此，抑制细胞外基质成分过表达是抗肾间质纤维化治疗DN的主要途径之一。止消通脉宁是北京中医药大学东直门医院著名老中医吕仁和教授治疗DN的临床经验方，作为院内制剂已在临床应用多年，在治疗DN方面具有较好的临床疗效[2-4]。本实验通过观察止消通脉宁干预转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和纤连蛋白（FN）等细胞外基质（ECM）成分表达的影响，进一步探讨其对肾间质纤维化的作用，为其防治DN肾间质纤维化提供依据。 　　1 实验材料 　　1.1 细胞株 　　HK-2细胞株，购自兰州大学实验中心。 　　1.2 药物与试剂 　　DMEM/F12（1∶1）细胞培养基，Gibco公司；胎牛血清， Hyclon公司；EDTA、胰蛋白酶，Amresco公司。人重组TGF-β1， RD System公司生产，根据说明书配成1 ?g/mL的储存液， -70 ℃储存，用时配成10 ng/mL浓度[5]。人ColⅠ、ColⅢ、FN mRNA引物均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。止消通脉宁颗粒，北京市金药源药物研究院提供，批6 g/袋，成人临床用量1袋/次，3次/d。 　　1.3 主要仪器 　　二氧化碳培养箱，HEAL CELL HL90，LI KANG；超净生物安全柜，ESCD CLASSⅡBSC，Airstream；倒置显微镜，Olympus X-71，Olympus，JAPAN；PCR仪，型号ABI7300，ABI公司。 　　2 实验方法 　　2.1 止消通脉宁含药血清制备 　　SPF级Wistar雄性大鼠48只，购于甘肃中医学院动物中心，饲养于兰州军区总医院屏障级动物实验室，普通饲料喂养。随机分为空白组及止消通脉宁低、中、高剂量，每组12只。止消通脉宁颗粒各组分别按成人临床用量的5、10、20倍灌胃，空白组灌服等体积生理盐水，每次1 mL/100 g体质量，上下午各1次，间隔12 h，连续灌胃3 d。于末次灌胃前8 h禁食不禁水，30 min后，大鼠股动脉无菌采血；静置2 h，3 000 r/min冷冻离心20 min，取上清，将同组血清混合；56 ℃水浴灭活30 min， -20 ℃低温保存备用。 　　2.2 细胞培养与分组 　　HK-2细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 ?g/mL 链霉素DMEM/F12（1∶1