miRNA—10a在胃癌中的功能及其甲基化调控.docVIP

miRNA—10a在胃癌中的功能及其甲基化调控 　　[摘要] 目的 研究miRNA-10a在胃癌中的表达及其在胃癌中的功能，探讨其启动子区的高甲基化与胃癌发生的相关性。 方法 使用Taqman探针对35对胃癌组织标本进行实时定量PCR检测，统计学分析miRNA-10a的表达情况与临床病理因素的相关性，随后使用甲基化特异性PCR（MSP）检测样本中miRNA-10a上游启动子区的甲基化情况。并通过细胞增殖实验研究miRNA-10a在胃癌细胞系中的功能。 结果 在35对胃癌样本中，其中，24例miRNA-10a的表达水平下调，11例表达水平上调。与临床病理因素的相关性分析显示，miRNA-10a在胃癌组织中的低表达，与胃癌的TNM分期呈负相关（P 0.05）。MSP结果显示，癌组织的甲基化水平明显高于相对应的癌旁组织，差异有统计学意义（P 0.05）。细胞增殖实验显示，过表达miRNA-10a后能够明显抑制胃癌细胞的增殖速度。 结论 胃癌组织中miRNA-10a的表达呈现普遍的低表达趋势，且miRNA-10a的低表达与胃癌的TNM分期呈负相关，其启动子区的高甲基化可能是导致miRNA-10a表达下调，参与胃癌发生的原因之一，并且miRNA-10a可能在胃癌的发生中起肿瘤抑制基因的作用。 　　[关键词] miRNA-10a；胃癌；甲基化 　　[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）07（b）-0004-04 　　全球每年有九十多万胃癌新发病例，其中42%的病例发生在我国，胃癌是我国最常见的恶性肿瘤，其发病率居各类肿瘤的首位，我国每年约有17万人死于胃癌，几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4，且每年新发胃癌患者超过2万例，严重威胁人们的身体健康[1]。相对于其他恶性实体肿瘤，胃癌的预后较差。早期胃癌患者症状不明显及缺乏行之有效的筛查手段，多数胃癌患者就诊时已属疾病进展期，预后极差，5年生存率仅为7%，晚期胃癌的化疗有效率为40%～50%，中位生存期不超过12个月[2]。所以除继续完善现有的治疗方法外，积极预防胃癌的发生，尽早诊断早期癌变，发展新的有效的治疗手段成为一项重要的工作。 　　MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为21～25个核苷酸的小分子RNA，通过与mRNA 3′UTR区互补结合，在转录后水平抑制靶基因的表达。目前的研究表明，miRNA可以影响细胞增殖、分化和凋亡，通过类似癌基因、抑癌基因或其他方式调控肿瘤的发生[3-4]。DNA甲基化是最早发现的DNA修饰途径之一，miRNA基因启动子区的高甲基化可导致其表达降低，在癌变过程中扮演着重要角色[5-6]。本研究拟在35例胃癌病例中调查miRNA-10a的表达情况及其启动子区的甲基化水平，并通过转染miRNA-10a类似物到胃癌细胞系HGC-27和MGC-803观察对细胞增殖的影响，探究其在胃癌发生中的作用，并研究其潜在的治疗价值。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　选取2011年5月～2012年3月山西医科大学第一医院收治的35例病理学诊断明确的患者手术切除后的新鲜胃癌组织及相应的癌旁组织（距肿瘤边缘5 cm）。所有患者均签署知情同意书，所取标本手术切除后立即放入液氮中保存。本组患者中，男性29例，女性6例。胃癌细胞系HGC-27和MGC-803购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。 　　1.2 试剂 　　RNA提取试剂盒Trizol（Invitrogen公司），反转录试剂盒（Promega公司），实时荧光定量PCR试剂盒（Takara公司），DNA提取试剂盒（Biomed公司），亚硫酸盐处理试剂盒（Qiagen公司），甲基转移酶（NEB公司），琼脂糖试剂（Invitrogen公司），琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（New Industry公司），DNA测序（华大基因公司），mimic（上海吉玛公司），Dharma FECT1 Reagent（Dharmacon公司），CCK-8试剂盒（DOJINDO公司）等。 　　1.3 仪器 　　冷冻台式离心机（Hettich，Germany公司），PCR仪 （MJ PTC-100），Real-time PCR仪CFX96（Bio-Rad公司），-80℃冰柜（Sanyo公司），紫外分光光度计（Thermo公司），MilliQ Plus超纯水系统 （Millipore公司），微量加样器（Eppendorf公司），电泳仪（北京百晶 Bio-Rad公司）。 　　1.4 实验方法 　　1.4.1 实时荧光定量PCR Trizol法提取总RNA，紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度，茎环引物反转录成cDNA，Taqman探针法对miRN