人卵巢癌細胞系A2780中肿瘤干细胞的分离培养与鉴定.docVIP

青岛大学 硕士学位论文 人卵巢癌细胞系A2780中肿瘤干细胞的分离培养与鉴定 姓名：刘佳 申请学位级别：硕士 专业：妇产科学 指导教师：纪新强  中分离培养卵巢癌干细胞球体，并对其特性进行鉴定。 ????????，??中获得肿瘤细胞微球体，流式细胞仪检测细胞表面标志 师：纪新强教授 关键词：卵巢癌；肿瘤干细胞；无血清培养基；悬浮培养  ?? ?????篢? ?????????? ????? ?????甌? ? ??????? ?．??????? ? ?? ??????????． ????篊?? ?????? ??? ?? ??????甌? ???? ?? ?? ?? ???? ??? ?? ? ??? ??????．? ?? ?? ????甋????????：??? ?? ?? ?? ? ????篢? ??琻????? ?? ?? ????，?? ??? ? ???．??琽? ??? ????????? ????? ?? ????????? ?? ????瑆?? ??????? ? ? ??．???? ??????????  干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的早期未分化细胞，在特定情 况下，可以分化成不同的功能细胞，形成多种器官和组织。肿瘤干细胞，也称癌干 细胞，是指癌组织中存在的数量极少的具有自我更新及分化潜能的细胞，它是正常 干细胞或前体细胞在一系列内外因素的作用下增殖分化失常形成的，因此，有学者 其中存在极少的可自我更新、无限增殖且不定分化的肿瘤细胞，具有高致瘤性，是 基因，如???、??畑????，????等，破坏自我更新及分裂信号转导途径的 负反馈机制。 非增殖细胞，超过?％的干细胞处于细胞周期的?．?期，处于?虶?疢期的细胞比  青岛大学硕士学位论文 ?????????利用生 成更多细胞球体，反映了细胞的自我更新和无限增殖潜能。细胞微球体在不同诱导 条件下可分化为不同细胞，反映了肿瘤干细胞的多向分化潜能。本研究采用的无血 清悬浮培养法兼具分选和鉴定功能，且克服了?分选后的细胞后续培养较困难及卵 巢癌缺乏特异的细胞表面标志等不利条件，为我们针对肿瘤干细胞靶向治疗及从根 本上根治卵巢癌提供实验思路及理论基础。  ??细胞系 ??主要实验试剂 优级胎牛血清和???ヒ鹊鞍酌??????????天津灏洋生物制品科技有限 ????培养基和??／?????嘌??美国?????? ??．??．????????，??．???甈?美国???????? ?????∈遥????嘌?浚??冻存管，?住??准??紫赴?嘌??美国 ??主要实验仪器 流式细胞仪?拦鶥????????? 超净工作台?罩莅蔡㏒??．?? ??????虳??疐?基础培养基：分别将两种袋装粉剂培养基溶于??? 双蒸水中，磁力搅拌溶解，加入??? ?畉  青岛大学硕士学位论文 ／?。 ???缓冲液：将粉末试剂溶于???的双蒸水中，磁力搅拌溶解，????疞 ??及????疞??鱬??．??褂?．? ? 分装，．?℃保存。 ? ? ???液：将??奂??? ??杭尤??? ? ? 化。用时加入???的????培养液，混匀。 分溶解，将??溶液过滤除菌，分装于?管中，置于．?℃保存。 ??含血清培养基?????????????，??的配制：????培养基内 ??／?。 ??无血清培养基???．??  ??．?殉舶┫赴?礎??细胞的培养与传代 ①当培养瓶瓶底长满细胞时，将培养瓶中的旧培养液弃去。 ③所得细胞沉淀用??匦??剖?寮剖??髡?赴?芏任???／?。 ④继续在?℃、???饱和湿度培养箱中培养，每日在倒置显微镜下观察细胞生 长情况。 后细胞球体积较大，形状趋于规则，球体数量增多。 ⑦以后每???ù?次。 ③避光操作，室温孵育??????痬?离心??。 ④弃去上清液，加入???  青岛大学硕士学位论文 的聚碳酸酯膜上，此铺胶全过程均在冰上操作。 ? 指???赴?拇┠な?。  和湿度培养箱中常规培养。 ?．?％??消化液消化?种雍蟠荡虺傻ハ赴??海?剖?笠???／?密度仍  第二章结果 第二章结果 ??显微镜下观察卵巢癌微球体的形成 ?的表达 两种细胞表面??、???泶锏牟钜煊型臣蒲б庖?????，微球体细胞比普  青岛大学硕士学位论文 免疫荧光强度 图??两种细胞的??染色流式细胞直方图 肿瘤微球体细胞 ?．? ?．? ?．? ?．? ?．? 肿瘤微球体细胞的荧光强度平均值又为?．??段????????籄??细胞的荧光强  免疫荧光强度 肿瘤微球体细胞 ?．? ?．? ?．? ?．? ?．? ?小室侵袭实验结果 ?  青岛大学硕士