表没食子儿茶素没食子酸酯对原代培养大鼠中脑细胞的作用.docVIP

表没食子儿茶素没食子酸酯对原代培养大鼠中脑细胞的作用 　　[摘要]目的观察表没食子儿茶素没食子酸脂（Epigallocatech in Gallate，EGCG）对中脑原代培养细胞的作用。 方法采用大鼠胚胎中脑原代细胞培养法，培养中脑神经细胞，再将细胞 分为空白对照组、阳性对照组、实验组，给予EGCG和神经生长因子（nerve growth factor ，NGF）进行配组干预，然后观察细胞生长状况，同时运用四唑盐（MTT）比色法检测神经细 胞活性；用抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）对多巴胺能神经元（dopaminerg ic neurons，DA）行免疫荧光染色，比较各组阳性神经元数目及突起的变化情况。 结果实验组（EGCG组）培养细胞生长旺盛，轴突延长，相互交错。MTT法 测得细胞吸光度值（A值）及免疫细胞化学TH阳性细胞数实验组与空白对照组比较差异有统计 学意义（P005）。 结论EGCG对中脑原代培养细胞及DA神经元有一定的保护作用。 　　[关键词]表没食子儿茶素没食子酸脂；中脑原代培养细胞；酪氨酸 羟化酶 　　中图分类号：R338文献标识码：A文章编号：1009_816X （2013）02_0114_03 　　流行病学研究显示，长期饮用绿茶可使帕金森病（Parkinsons disease，PD）的患病率下降 [1]。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin Gallate，EGCG）是从绿茶中 提取的主要活性成分，是重要的天然抗氧化剂，具有明显的抗氧化作用。有研究显示，EGCG 能 透过血脑屏障，减少氧自由基所致神经细胞损伤，具有对抗氧化应激因素诱导的PC12细胞和 SH_SY5Y细胞凋亡的作用，可抑制帕金森病小鼠模型诱导型一氧化氮合酶的表达[2，3 ]，保护神经细胞，具有潜在治疗神经退行性疾病的价值[4]。然而，EGCG对原代 培养的中脑神经细胞 是否具有保护作用，目前尚未见报道。本实验旨在通过观察EGCG对胚胎大鼠中脑原代细胞及 多巴胺能神经元（dopaminergic neurons，DA）的作用，进一步探讨EGCG防治PD的可能性。 　　1材料和方法 　　12方法： 　　121中脑原代神经细胞的培养：将孕15d SD大鼠脱颈致死，75%乙醇浸泡消毒，超净 台内 无菌分层解剖取出子宫，用D_hanks液洗净，置于盛有D_hanks液的平皿中，剪开子宫，取出 胚胎，在解剖显微镜下轻轻剥出完整的脑组织，将腹侧面朝上，沿视神经根下沿和脑干部横 切两刀，精细解剖镊分出中脑黑质部，剔除残留脑膜及血管，将所取组织块剪碎后加入01 25%胰蛋白酶（Trypsin 1：250），于37℃ 5% CO2培养箱中温育25min，然后在完全培养液 中 放置10min，终止胰蛋白酶作用。800转/分离心5min，吸弃上悬液，加培养液。用火焰刨光 的直头滴管吹打10次，静置沉淀大的组织块，吸取上悬液，调整细胞浓度，按照2×105、 1×105细胞/孔分种于涂有多聚赖氨酸的24孔和96孔塑料培养板内，置37℃，5% CO2培 养箱内 培养。 　　122药物处理：培养的标本随机分为空白对照组、阳性对照组和实验组，接种3天后， 细胞 更换新鲜培养液继续培养，接种第6天再换液一次，实验组换液时培养液中加终浓度为10umo l/L的EGCG，阳性对照组加入NGF（终浓度50μg/L），空白对照组加入正常培养液。 　　123四唑盐（MTT）比色法：培养第7天，给同一批培养在96孔的细胞中加10μL/孔MT T（ 5g/L），继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，然后每孔加100μL二甲基亚砜 （DMSO）溶液，终止MTT反应，振荡10分钟，使MTT反应的蓝色结晶充分溶解，然后放在Bio_ RAD680型酶标仪上测细胞吸光值（A值），采用检测波长570nm，参考波长630nm，每组各观 察25孔。 　　124抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫荧光染色：用95%酒精固定 培养 细胞20min，001mol/L PBS洗3×5min/次，边洗边振荡。然后滴加抗体稀释液稀释的小鼠 抗 大鼠TH抗体（1∶3000稀释），置37℃湿盒中30min，PBS洗3×5min/次，除去非特异性吸附 的抗体，减少背景染色。滴加荧光标记的羊抗小鼠IgG_FITC，置37℃湿盒中30min，PBS洗3 ×5min/次。揩干玻片周围水分，荧光显微镜下观察，计数阳性细胞数，每组随机选取40个 视野。 　　13统计学处理：采用SPSS100版统计软件，测定值用（x-±s）表示，进行单因素方差分析。P005为差异有统计学意 义。 　　2结果 　　21细胞