SNP检测方法__培训课件.pptVIP

国内研究者在单个基因的SNPs与疾病相关性方面进行了大量研究。如应用实时荧光技术分析N-乙酰基转移酶基因多态性与肝癌易感性的关系，结果表明，携带N-乙酰基转移酶基因慢乙酰化基因型的吸烟者可能是肝癌的高危人群。 目前已有实验将SNPs 应用于肿瘤预后及易感性的判断。如日本学者发现了HER-2 基因编码区的一个SNP 与胃癌的发展及恶性程度有关。 SNP应用前景 1、人类学研究中的应用：人类进化、不同人群、民族之间的关系、人类的起源、人类的迁移等（例如Y染色体SNP分型）。 2、遗传病的诊断和疾病的关联分析。 3、疾病相关基因的定位和克隆。 4、法医学中的个体识别和亲权鉴定。 5、个体化疾病预防，真正进入预防医学时代。 6、药物基因组学的应用：新药设计与发明，个体化疾病治疗与用药。 * 稳定性就反映在Tm值的改变。 * 根据其中其中一种ASO的Tm值，设计反应条件，在此条件下只有匹配的基因能够很好的杂交，得到预期的结果。（为了提高杂交的严格性,能更好的区分出SNP位点，往往采用修饰过的核苷酸探针和样品DNA杂交 ），如果差异越大，效果越好。 通过设计一段短的核苷酸探针(一般15～20 bp) ,其中包括了SNP位点,当其与样品DNA 杂交时,由于在20bp中一个碱基的差异会导致Tm值下降5～7.5度,所以通过严格控制杂交条件,就可以鉴定出样品DNA中是否存在（已知的）SNP。这是最简单的基于杂交原理的检测方法。（Tm值） 在探针内人为的插入错配碱基,用这种含有错配碱基的探针杂交时,探针和目的片段之间一个碱基的差异导致Tm值的下降是传统杂交的2倍,因此,大大提高了杂交的特异性。 Tm=2(A+T)+4(G+C) (15-20个bp),一个碱基的差异会导致Tm值下降5～7.5度（A+T)=15 (G+C)=5, Tm=30+20=50, Tm=81.5度+16.6（Ig[K+]+0.41(G+C)%－675/n（溶链温度与离子浓度成正比，与（G+C）成正比，与核苷酸个数成正比。 变性温度比溶链温度高几度；复性温度比熔链温度低3-5度。 * PNA是一种核酸类似物，与核酸最主要的区别为其骨架是肽键，而不是核酸的磷酸二酯键骨架，在肽键骨架上连有相应碱基，从而具有以下特征：1、热稳定性 一个PNA碱基杂交体的Tm值的贡献平均高1摄氏度，例如：一15个碱基对的PNA形成的PNA/DNA复合体的Tm值通常为70度左右,并且其Tm值受盐浓度影响很小（正常的核酸对Tm的影响和盐浓度的关系）。 2、与靶分子高特异性地结合 因为其杂合体Tm值高，更重要的一点是其Tm值受盐浓度很小，因此在低盐浓度的体系中会极大的降低非特异的DNA之间的结合。另外因为一个PNA碱基的错配平均会使其Tm值降低15度（8-20度），这样PNA/DNA的非特异结合也能得到很好的排除。3、链挤入 PNA能和挤入含有互补配对碱基区的双链DNA形成三链复合结构，这一特性为其在表达调控以及反义治疗方面提供了较大的应用空间。 4、对核酸酶和蛋白酶均不敏感 这对于在体外应用来说有较大的价值。 * 2、与靶分子高特异性地结合 因为其杂合体Tm值高，更重要的一点是其Tm值受盐浓度很小，因此在低盐浓度的体系中会极大的降低非特异的DNA之间的结合。另外因为一个PNA碱基的错配平均会使其Tm值降低15度（8-20度），这样PNA/DNA的非特异结合也能得到很好的排除。 * LNAs是一种合成的核酸类似物,其结构是在RNA分子的2′羟基和核糖环的4′碳原子间连入一个亚甲基的“桥”,由于“桥”的作用使核糖环处于更利于杂交的稳定构象,所以能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合,而这种高的亲和性甚至在有一个错配碱基都会大大降低,因此用此作为探针来检测单核苷酸多态性。 * * 分子信标是一种新型的发卡结构的寡核苷酸探针,是在样品PCR过程中因和样品DNA 杂交后而使自身荧光构象改变从而实现对SNP的检测(原理见图1) 。分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop) 的两部分构成,茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形成的,又可称之为手臂,环则是探针的中间部分,其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP 位点。在手臂的两个末端分别通过共价的方式结合上一个荧光分子和一个荧光猝灭基团,这样当分子信标游离在溶液时,它以发卡结构存在,荧光分子与猝灭基团在空间距离上挨在一起,十分接近,荧光分子被猝灭,此时溶液无荧光信号。相反当分子信标和其完全互补的目的片段杂交时,其发卡结构被拉开而使荧光分子和荧光猝灭基团在空间上分开从而发射出荧光,其信号可提高900倍。研究表明这种发卡结构的探针在和目的片段杂交时的特异性很高,对于仅相差一个碱基的目的片段都能够区分,因此用于SNP位点的检测,同