微生物实验室质量控制__培训课件.pptVIP

常用菌种的保藏方法 2、半固体高层培养基穿刺培养 3、液体石蜡覆盖保藏法：本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理、升化水平，延长菌种保藏时间。方法：选择优质液体石蜡，121℃高压灭菌30min后在160℃烘箱1～2h除去掉水分冷却后备用。取经培养的高层半固体菌管加入液体石蜡，高出培养基面1cm为宜，放入4 ℃保藏。可保存半年或一年。 常用菌种的保藏方法 4、冷冻真空保藏法 保护剂：有多种，多用脱脂牛奶。将牛奶煮沸、静止、冷却除去上面一层脂肪，重复3次后用脱脂棉过滤，灭菌。 菌悬液制备：直接刮取用营养琼脂培养基培养的细菌，悬浮于分散剂中。用液体培养基培养的细菌，哀告离心沉淀倾出上清液，加入分散剂。 菌悬液浓度：109～1012cfu/ml。 低温、冷冻、真空干燥置-35 ℃保存。 常用菌种的保藏方法 5、液氮保藏法 保存：制备菌悬液，用甘油或二甲亚砜作保护剂，分装安瓿，每管0.5ml，预冻至-40℃（控制温度下降速率为1℃/min)，放入液氮生物贮存罐中保存。 恢复：直接浸入38℃水浴中解冻5～10min，转种于适宜培养基内培养。 注意：大多数属种适于慢速冻结和快速冻结。 蒸馏水保藏法 6、蒸馏水保藏法 在斜面培养基上加无菌蒸馏水5～6ml，用吸管轻轻吹散表面菌苔，移入灭菌螺旋口小试管中，盖严盖子在室温保存。 霉菌、酵母和放线菌、植物病原菌可在室温保存数年。 玻璃珠保藏法 7、玻璃珠保藏法 无菌操作将菌悬液加入玻璃瓶中，充分搅动包被玻璃珠，移去多余悬液。 标记后保存-60～85℃冰柜。 不同颜色有助菌株辨别。 使用使取出1粒用相应培养基培养 需氧菌—营养肉汤，厌氧菌——强化梭状芽孢杆菌培养基。 嗜盐菌—盐营养肉汤加15%甘油。 甘油低温保藏法 8、甘油低温保藏法 菌种悬浮在10%～15%甘油蒸馏水，超低温冰箱保藏（ -70～80 ℃ ）。 菌种最好培养至对数生长期。 使用液体培养基时，可直接加到已灭菌的甘油中，使甘油终浓度10%～30%。 分装于冻存管中，避免反复冻融。 基因工程菌及难以冷冻干燥的丝状真菌。 适用菌种的保藏方法 液氮保藏法适用菌种：病毒、支原体、各类细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、动物细胞等。 甘油低温保藏法适用菌种：细菌、酵母菌、丝状真菌、基放线菌和基因工程等。 液体石蜡覆盖保藏法适用菌种：真菌、酵母菌、多种细菌。不适用菌种：乳酸杆菌、分枝杆菌等。 菌种的传代 将在适宜的培养基上生长良好的培养物（庖肉培养基、半固体、高层琼脂）放置在低温处保存，使细菌停止生长或缓慢生长。 当培养基中营养成分被利用完以前或尚未陈旧以前，将它重新移植于新鲜培养基，再于适宜条件培养，生长良好后，再置低温保存。 菌种的传代 最好每株接种两管以上，需定期移种。 培养基表面需加灭菌液体石蜡，用橡皮塞代替棉塞，以防止干燥脱水。 传代菌株采用斜面、穿刺方法、液体。 多数菌株要求保藏温度为4～5℃。 反复传代后，在使用前需进行确认试验。 一般1个月～6个月传代一次。 适用菌种：大肠、沙门、铜绿、金葡、生孢、枯草、短小、藤黄、白念、黑曲等。 菌种检查和复壮 经过长期保藏和传代的菌种，由于种种原因易发生衰退、变异或死亡，因此各类菌种在保藏期间必须定期检查，发现变异或衰退，应及时给予恢复。 定期检查： 在一定间隔时间需重新复活、分离、纯化、鉴定再保藏。 检查项目：菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性及血清学检查。 防止菌种衰退 控制传代次数。 采用有效的菌种保藏方法。 创造良好的培养条件。 利用不同类型细胞进行接种传代。 菌种的复苏 对已保藏的菌种进行恢复培养，使其恢复至保藏前状态。 液氮超低温保存：配置合适的培养基；解冻与恢复培养（迅速放入38℃～40℃水浴中震荡5～10min 解冻）；开启安瓿，将菌种移入相应的培养基中，在适宜的温度下培养。 菌种的复苏 使用真空冷冻干燥保存：开启安瓿瓶，滴入无菌生理盐水或营养肉汤0.5ml，溶解后摇匀，悬液移入相应的培养基中，在适宜的温度下培养。 冷冻菌种复原：使用复苏培养液，对活性较弱的菌种（弧菌属）可另加入其他物质提高存活率。 菌种的使用 专人负责 详细登记 定期移种 安全管理 确认实验 复壮 注意事项 菌种的使用 传代保藏的菌种，最多使用到第五代，每次转接尽量扩大子代管数。 经冷冻保存的菌种，复苏时应一次用完，避免反复冻融。 菌种使用完毕，应按规定方法灭菌后弃置，注意人员防护。 我所标准工作菌种复苏方法 1、复苏菌种前应准备适于该菌种生长的培养基和培养设备，所有的操作应在符合生物安保护及无菌条件下进行。 2、扭开冻存管前，先用75%的乙醇棉球消毒菌种冻存管外壁，注意记住菌种的标记名称（一般要求每次只打开一种菌种），用灭菌吸管将冻存管内的菌悬液全部吸出，接