第五章 离子交换层析20130321.ppt

（二）离子交换柱长度的影响 离子交换柱的长短对蛋白质的分离影响不是很明显，如一支柱床高度为25cm和5cm的离子交换柱对蛋白质的分离没有多大差异。因此，离子交换柱一般都选用短粗的层析柱，柱长容易造成分子筛效应，使保留值延长，引起洗脱峰的扩散，出现重叠现象。使用短柱优点是洗脱体积相对比较集中，相应的浓度比较高，容易提高检测灵敏度，柱的负载少，操作压小，有利于提高流速。（三）缓冲溶液的影响 缓冲溶液的影响包括溶液的pH值、缓冲容量、离子强度等因素。 57 1．pH值影响 对弱电解质和两性解离的生物大分子，在离子交换层析分离技术是通过调节缓冲液的pH值来控制样品的解离度或所带电荷的性质及净电荷量。例如在分离蛋白质时，缓冲液的pH值高于蛋白质的PI带负电荷；低于蛋白质的PI带正电荷。所以缓冲液的pH值可以决定蛋白质带什么样的电荷，决定选择什么样的离子交换介质。如果缓冲液的pH值选择不当，将会给整个分离系统带来负面效应，如吸附率差、回收率低、杂质多等。 58 2．缓冲容量的影响 缓冲容量主要是对溶液的pH起平衡作用，在离子交换层析过程中使溶液的pH值保持稳定。某些蛋白质在分离过程中解离度发生变化，当缓冲溶液的缓冲容量不能缓冲样品引起的pH值变化时，溶液的pH值发生漂移，导致解离度发生变化，从而影响溶质的交换量。 59 3．缓冲液浓度的影响 离子强度增加，离子与被分离物的亲和力增大，从而降低了被分离物质与离子交换介质的亲和力，抑制了被分离物质与离子交换介质的交换作用，还会导致已结合上去的物质被洗脱下来。4．杂质的影响 由于生物大分子的结构中同时存在着正负两种电荷，在溶液中解离后形成的离子受到与它性质相近电荷相反的某些杂质的影响，样品中的离子化合物受溶液中反离子静电引力作用形成的离子键，反离子与离子交换基团相互排斥，具有阻止样品与交换介质活性基团的交换作用。 60 （四）流速的影响 流速直接影响交换介质的交换率。由于离子交换层析分离过程是一个动态发生交换的过程，被分离的物质从溶液中(流动相)到与介质发生交换(固定相)有一个时间差。在其他的条件不变的情况下，就流速而言，如果流速慢，溶液中的离子流过介质所需要的时间长，容易与介质发生交换作用。否则相反，不易与介质发生交换作用。 61 关于流速的影响，Giddings已有详细的论述，他指出分子扩散系数的减小，使得扩散到介质孔内孔外的分子随之减少。相对分子质量增大，扩散系数降低，质量传递的问题也显现出来。因此增加流速会恶化质量的传递。例如：分离一种相对分子质量为70 000的蛋白质，若要保持与小分子一样的柱效，流速必须降低10倍，相当于小分子量速度的1／10。 62 第九节 离子交换剂的处理与再生 新购买的离子交换介质和使用多次柱效下降的交换介质要进行处理和再生。再生和处理的方法要根据介质载体的性质不同分别进行，具体操作如下。（一）聚苯乙烯树脂类介质 ①新使用的介质 首先用70％乙醇浸泡，除去介质中少量的脂溶性物质，然后分别用lmol／LHCl和lmol／L NaOH进行处理。 63 ②使用过的离子交换介质 一般用上述浓度的酸、碱或1mol／ L ．NaCl溶液再生，即可。(二)纤维素粉类介质 ①新的离子交换介质 首先用70％乙醇浸泡，然后用0．5mol／L HCl和0．5mol／L NaOH分别处理。 ②使用过的离子交换介质 一般用上述浓度的酸、碱或lmol／LNaCl溶液再生。 64 （三）凝胶类介质 凝胶类介质多数是多糖类载体，在分子中有许多糖苷键，在强酸强碱下容易发生水解，尤其是在强酸溶液中糖苷键容易断裂。所以要避免强酸强碱。 Sephadex可用0．1mol／LHCL和0．1mol／LNaOH进行处理。Sepharose可用0．5—1．0 mol／L．NaCL或0．1～0．5mol／LNaOH快速洗脱处理。 65 （五）理化性质 刚性 指介质耐受外界压力的程度，即在较高的操作压下介质不变形，柱床体积保持稳定。 物理稳定性 对热的耐受程度，在较高的温度下交联度不发生改变。 化学稳定性 一般是指在0．5一lmol／L的强酸或强碱溶液中或高浓度的盐溶液中，化学性质保持稳定，化学键不发生断裂或降解反应，并具有较强的抗氧化的能力。 25 第六节 离子交换层析技术（一）离子交换层析介质的选择  在液相层析分离中，选用阳离子交换层析介质还是阴离子交换层析介质，主要取决于被分离物质所在溶液中的解离度及解离后离子所带电荷的性质(正电荷或负电荷)。如果是正离子应当选用阳离子层析介质，负离子选用阴离子层析介质。选择的基本原则如下。