3.3_NA_cloning_PCR_ligN2概述.pptVIP

3. PCR反应体系 * 一个标准的PCR反应体系（50~100 μl）： 50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl（pH=8.4） 100 μg/ml 明胶或牛血清白蛋白（BSA） 1.5 mmol/L MgCl2 2个引物，各0.25 μmol/L dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP 各200μmol/L 模板DNA（人基因组DNA） 0.1~1μg Taq DNA聚合酶 2 U * Predenaturation 94 ℃, 4 min Denaturation 94 ℃, 0.5 min Primer annealing 55 ℃, 0.5 min Extension 72 ℃, 1 min (30 cycles) Final extension 72 ℃, 10 min 4. PCR产物的鉴定 1) PCR产物的大小和限制酶谱分析 * ??????????? DNA扩增产物, 直接定序或经过克隆再定序. 2) 核苷酸序列分析 * 5. PCR产物的克隆 具A-尾的PCR产物: 纯化,连接T-vector,转化,筛选重组克隆; 鉴定(定序) 平端PCR产物: 直接与平端载体连接